Кератин после окрашивания или до: Когда можно делать окрашивание после процедуры кератина?

до или после кератинового выпрямления? Через какое время лучше делать покраску волос? За какое количество дней лучше красить голову до выпрямления?

Окрашивание волос

Современное общество диктует строгие правила к внешнему виду. Девушки поддаются этим тенденциям и постоянно меняют свой образ. Например, если рассмотреть моду на цвет волос, то 2015 год – это однотонный цвет, 2017 год показал такую технику, как балаяж, а вот в 2019 году модные критики рекомендуют возвращать естественный цвет волос. Все эти изменения плохо влияют на волосы. Процедура кератинового выпрямления помогает привести волосы в порядок и создать благородный вид. На вопрос, когда лучше делать процедуру: до покраски или после, ответим в данной статье.

Выполнение процедуры

Кератин, который содержится в составах для выполнения сеанса выпрямления, способствует разглаживанию волос.

Помимо ровных прядей, клиентки приобретают ещё много преимуществ:

• блеск по всей длине;
• легкость расчёсывания и приятную структуру;
• закупоривание секущихся концов.

Биополимер кератина позволяет добиваться подобного эффекта, так как он является главным элементом в структуре волоса. Этот элемент создаёт целостность волоска, а с помощью термофиксации образует защитный слой.

Рассмотрим, как происходит процесс выпрямления.

1. Перед сеансом волосы моют с особым шампунем.
2. Обязательно делают 3 равномерных пучка, с которыми будут работать поэтапно. Это позволяет одинаково распределить препарат для выравнивания.
3. Распределение начинается от корней, с отступом ориентировочно в 2 см по тонким рядам.
4. После нанесения всего препарата волосы расчесывают для равномерного распределения.
5. С помощью фена и щётки для укладки сушат пряди.
6. Для образования защитного слоя производят термообработку выпрямителем.

На выполнение сеанса необходимо уделить ориентировочно 4 часа. В течение двух дней препарат ещё выполняет свою работу, поэтому в этот период волосы нельзя мыть и делать с ними причёски.

Как окрашивают?

Перед тем как приступить к главному вопросу, стоит разобраться, что происходит со структурой волос в момент окрашивания. Основной состав краски – это перекись водорода и щелочные элементы. Первый компонент окисляет и проявляет пигмент. Второй помогает красящему пигменту попасть в волосяные чешуйки.

Во время окрашивания:

1. мастер распределяет красящую массу от корней до концов волос с помощью специальной кисти;
2. щелочные элементы способствуют попаданию краски в чешуйки;
3. перекись водорода позволяет волосам утратить природный цвет;
4. волосы приобретают ожидаемый оттенок.

Принцип окрашивания – это химическое проникновение в структуру волоса, что приводит к изменению цвета. Теперь можно начать разбираться с вопросом о времени окрашивания, если есть желание сделать кератиновое выпрямление.

Последовательность

Есть несколько вариантов того, как поступить с волосами, готовясь к кератиновому выпрямлению.

После

Первый вариант – это окрашивание волос после проведения процедуры. Конечно, в таком случае есть много нюансов, которые необходимо учесть.

Приступать к окрашиванию можно не раньше, чем через 2 суток.

Надо помнить, что сразу после сеанса волосы не должны подвергаться никаким физическим и химическим воздействиям. Голову нельзя мыть, нельзя делать причёски, особенно кудри. Если ослушаться этого правила, то не будет ожидаемого результата.

Процедура выравнивания действует на структуру волос таким образом, что чешуйки закрываются. Для изменения цвета волос волосяной фолликул необходимо как можно больше раскрыть, чему поспособствуют химические элементы в составе краски. Если этого не произойдёт, то волосы останутся прежнего цвета.

Поэтому идеальное время для окрашивания – не раньше, чем через 3 недели.

Спустя данное время кератин медленно уменьшает свою функцию, и защитный слой волоса сходит на нет. Чешуйки волоса будут снова готовы принять химические вещества краски. Соответственно, если сделать окрашивание ещё позже, то результат будет эффективнее.

До

Второй вариант – это окрашивание волос перед процедурой. Этот вариант считается более благоприятным. С помощью сеанса выпрямления, цвет запечатается внутри волоска и сохранит эффект надолго, также он будет насыщенным.

Но, как и в первом варианте, есть определенные нюансы, которые необходимо соблюсти. Предъявляется требование по времени окрашивания перед процедурой. Если окрас осуществляется в естественные и тёмные оттенки, то до сеанса должно пройти минимум 10 дней. Если необходимо добиться светлых оттенков, то процедуру кератинового выпрямления можно проводить не раньше, чем через 20 дней. Самое продолжительное восстановление после окрашивания (30 дней) нужно после выполнения техники мелирования.

Есть ещё один совет от профессионалов. Если локоны подвергаются окрашиванию, то к выбору краски стоит подходить со всей ответственностью.

Предпочтение надо отдавать краскам без содержания аммиака.

Это позволит избежать глубокого повреждения волосяных фолликулов, так как кератин закрепляет все элементы под защитным слоем.

Каждый сам выбирает способ, который подходит именно ему. Стоит только знать, что возможен вариант окраса и до процедуры, и после. И тот и другой выполнит свои функции. Нельзя однозначно сказать, что первая альтернатива лучше второй, и наоборот.

Полезные советы

Для того чтобы после изменения цвета волос и процедуры выравнивания с кератином волосы имели насыщенный и блестящий цвет, нужно выполнять следующие правила.

• Для изменения цвета прядей используйте только краски без содержания аммиака.
• Можно приобретать басму и хну. Они состоят из натуральных элементов и не портят структуру волос.
• Если было принято решение кардинального смены имиджа (из чёрного в светлый цвет или наоборот), то процедуру кератинового выпрямления производят не ранее, чем через 3 месяца.
• Не передерживайте состав во время окрашивания, четко соблюдайте инструкцию.
• Если в обычной жизни используется оттеночный тоник, то за несколько недель до процедуры от него следует отказаться. Причиной такого правила является то, что при термообработке волоса оттенок тонирующего средства изменится. Какой цвет получится в итоге, предугадать невозможно.
• Если выбор пал на процедуру в японской технике, то хну и басму нельзя использовать для окрашивания в течение года перед сеансом.

Подводя итоги, можно сделать следующий вывод: сеанс кератином и окрас волос могут сосуществовать вместе, но не одновременно.

Если требуется окрашивание волос, то необходимо соблюдать вышеперечисленные правила. В таком случае получится максимальный эффект от двух процедур. Кратко говоря, если окрас производится до процедуры, то надо соблюсти срок в 2 недели, а если после, то не раньше чем через месяц.

Однако не стоит забывать, что качество краски имеет сильное влияние на сокращение и увеличение сроков. Именно поэтому, решившись на дорогостоящее выпрямление, не стоит экономить на краске.

Техника окрашивания и кератинового выпрямления в один день приведена далее.

Кератиновое выпрямление волос COCOCHOCO — «После длительного окрашивания, химии и прочих надругательств кератиновое выпрямление становится, чуть ли не панацеей для моих волос! Чтобы не стричься *налысо* выбрала для себя лучший вариант восстанавливать волосы с COCOCHOCO! *Хуже уже не будет!* »

Всем привет!

Данный текст пишется в припадке радостного события после третьего применения по восстановлению и выпрямлению волос составом COCOCHOCO , поэтому будет многословен и полон эпитетов разной степени пышности.

______СОДЕРЖАНИЕ:________

1. О моих волосах.

2. Это надо знать.

3. Сам процесс

4. Мои впечатления

5. Советы и хитрости для длительного эффекта

6. Плюсы

7. Минусы

8. Итог.

1. О МОИХ ВОЛОСАХ:

Моим волосам пришлось вынести почти всё. Без преувеличений. Они еще живы, и надеются, теперь уже на самый лучший исход. *Хозяйка помудрела*

В свое время я совершенствовала волосы почем зря. Много раз красила в блонд. Недавно перекрасила волосы в более естественный тон.

Использовала очень много разнообразных средств для волос, руководствуясь надеждой, что всё не зря. Но волосы с годами всё тускнели и печально выпадали. Пила витамины, наносила витамин B1 на корни и втирала, приговаривая, «Потерпите волосики, потом лучше будет!» и сама верила. Старалась волосы не перенасыщать, а только увлажнять и подпитывать.

Но время шло, а состояние волос всё ухудшалось. Стали крайне сухие, на расчёсывание не отзывались, даже пролетающие мимо птицы искоса взирали на мою голову, признавая в этом свой дом-гнездо. Волосы становились, словно стог сена.

От природы волосы вьющиеся. Спадают кудельками, и совершенно непослушные. В данный момент волосы к концам пустые, обесцвеченные и ломкие.

Но! Не всё так слёзно-печально, нашла я выход и теперь восстанавливаю.

Впечатления у всех разные насчет кератинового выпрямления, буду глаголить за себя, при этом учитывая и другие мнения.

Уверена, с годами, *если еще что-нибудь не придумают производства для волос * обязательно буду снова и снова прибегать к данной процедуре.

Только это спасает мои волосы от короткой стрижки* налысо *

ПОСЛЕ второго применения спустя 4 месяца, ДО третьего применения

2. ЭТО НАДО ЗНАТЬ:

Многие утверждают, что все поголовно кератиновые составы ужасны, в одних больше, в других меньше вредных веществ, содержащих формальдегиды. После любого кератина невозможно в будущем восстановить волосы, так как структура уже изменена. Впоследствии, после применения выхода два- либо делать кератин всегда, без него уже никуда, либо после кератина, когда он сойдет сделать короткую стрижку, чтоб волосы росли уже новые.

Мне сложно сказать. Когда проходит несколько месяцев, лично я сплю и вижу, как снова иду на кератиновое выпрямление, поскольку нравится после применение состояние волос. Пусть я отношусь к первой категории, но я не готова расставаться с волосами и стричь их коротко. Наоборот, я, собрав волю в кулак, отращиваю.

3. Итак, сам процесс:

1.Мастер выбирает шампунь глубокой очистки.

2. Далее тщательно просушивает волосы феном.

3. Облачившись в защитную одежду, готовимся стать в разы красивее! Мастер тщательно распределяет прядь за прядью, и заранее приготовленным составом COCOCHOCO наносит кисточкой на всю длину волос, отступая от корней 1-1,5 см. и сразу прочесывая эту прядь несколько раз.

ВАЖНО! Если средство нанести больше, то чувствуется запах, в процессе режет глаза, открываем все двери и окна. Первые два раза не щипало, рези в глазах не было. На третий раз я почувствовала всю ядреность!

4. В ожидании результата томимся 30 — 40 минут.

Волосы в процессе

5. По окончанию времени, не смывая состав, снова сушка волос феном.

6.И вот, наконец, приступаем к обжиганию. Отдельные прядь за прядью, вместе с расческой прижигают утюгом (температура 230 градусов!), вытягивая.

Важно! После процедуры кератинового выпрямления COCOCHOCO в течение первых 3 дней после процедуры:

1. Не допускать попадание влаги на волосы (не попадать под дождь, не мыть голову). Это для меня самое сложное. Целых ТРИ дня! С трудом чищу зубы, чтобы не намочить локоны, смываю косметику с лица со словами «осталось два дня..потом один день..», успокаиваю, что так не вечно.

2. Не собирать волосы в хвост, не закалывать, не теребить. Волосы должны быть распущенными, ну да, зачем такую красоту гладкую прятать!

Процесс

4. Мои впечатления:

Накопительный эффект.

√ Первый раз сделала в августе 2014, продолжалось хорошее состояние волос всего 3 месяца. НО (!),,в ноябре я купалась в соленом море, кератин и соль — несовместимы. Вымывается.

√ Второй раз кератиновое выпрямление сделала уже в начале декабря 2014, эффект длился 5 месяцев.

Я снова не выдержала и пошла наперекор рекомендациям. Покрасила волосы. Из пергидрольной блондинки хотела стать натурально русой. Кератин не любит ни одну краску для волос, поэтому советуют мастера красить волосы ДО процедуры, а затем только корни.

√ В третий раз сделала в мае 2015. На лето. Осталась довольна.

5. СОВЕТЫ И ХИТРОСТИ ДЛЯ ДЛИТЕЛЬНОГО ЭФФЕКТА :

1. Существует подделка, бутылочку практически не отличить COCOCHOCO в которой есть формальдегид и после него поговаривают результат нулевой, а есть настоящий кератин COCOCHOCO. Обращайте внимание на цвет этикетки, он должен быть синим. Для блондинок голубой цвет. Вот после него и есть потрясающий эффект восстановления и разглаживание капризных кудрей.

2. Уход нужен однозначно, даже после кератинки!

Важный момент! После кератинового выпрямления все наши маски для волос, холенья- лелеянья воспринимаются волосами с двойной благодарностью! Волосы лучше в себя впитывают маски и уходовые средства. Волосы, словно новые, только что ожившие. Фанатично перегружать конечно не стоит, но поддерживать увлажнение и питание волос для себя считаю обязательным.

3. ПОМНИТЕ! Голову мыть только шампунями без SLS! Поскольку нам важно сохранить эффект кератина как можно дольше, значит нужно, как можно меньше его вымывать. Состав шампуней с SLS не щадит волосы, вымывая все накопления белка (кератина).

4. Еще мастер меня учила, чтобы дольше сохранить эффект, после мытья головы пользоваться феном, вытягивая волосы!

Понимаю ваше негодование, мол зачем тогда кератин, который и так выпрямит, а тут хитрят значит. Я тоже так думала, что после мытья головы, если не использовать фен, волосы снова превратятся в кудри, поэтому мол и советуют. Чтобы верила в эффект..

Ан нет! Не поэтому! Горячий воздух впитывает кератин. Мы его не видим на волосах, а он есть. Долгое время. И чтобы эффект сохранялся и не вымывался -мы его как бы «припечатываем » раз за разом. Я использую фен только примерно пять помывок, потом щажу волосы.

ДО и ПОСЛЕ

6.ПЛЮСЫ:

✔ Несколько месяцев можно лицезреть красивые волны ( поскольку у меня вьющиеся волосы ), ухоженный вид, не спутываются. И(!),как бонус волосы растут быстрее!

✔ За пять лет я не смогла отрастить локоны, как за полгода. Мой мастер недоумевает, но утверждает, что клиенты расхваливают кератиновое выпрямление, еще и потому, что волосы растут заметно быстрее. Хотя, в составе COCOCHOCO ничего не сулит для роста. Да, я понимаю, прямые волосы всегда выглядят длиннее, еще при этом они разглаживаются после процедуры, но у меня вьющиеся волосы, соответственно прирост узреть сложнее.

Могу предположить, что ускорение роста волос происходит за счет восстановления.

✔ Еще хочется выделить, что волосы не пушатся. Раньше ходила с пухом на голове, а сейчас забыла и думать об этом!

✔ Волосы становятся крепче, не выпадают, гладкие и ухоженные.

7. МИНУСЫ

Для меня только один. После процедуры кератинового выпрямления волосы становятся после мытья грязными буквально за день. Мыть приходится часто.

8. Итог:

Я не сильна в химии и физике, если послушать мнения людей, то получается двояко. Волосы обрабатываем огнем, как из пожарного гидранта, запечатываем 230 , а затем каждый раз после мытья обжигаем еще и феном.

Но я ни разу не разочаровывалась за всё это время, что выпрямляю волосы таким способом.

Больший вред для своих волос я принесу, если совсем перестану ухаживать.

Кератиновое выпрямление после мыться головы несет в себе не совсем выпрямление, а скорее разглаживание (приглаживаются волосы, становятся ухоженными и гладкими)

кератиновое выпрямление волос

кератиновое выпрямление волос

Я буду рекомендовать кератиновое выпрямление волос тем, кто точно в этом нуждается и как я, не щадил в свое время волосы. После длительного окрашивания, химии и прочих надругательств кератиновое выпрямление становится, чуть ли не панацеей для волос!

Желаю всем красивых, здоровых волос!

Спасибо за внимание!

Обзор самого обсуждаемого состава CocoChoco. Для меня это чуть ли не панацея – часть 2. Кератиновое выпрямление Cocochoco Gold — отзыв 2018 года

Также продукты для волос можно посмотреть здесь:

флюид реконструктор Ollin Professional BioNika

Безсульфатный отличный шампунь для окрашенных волос

Можно ли красить волосы после кератинового выпрямления?

Чтобы ответить на вопрос, можно ли покрасить волосы после кератинового выпрямления, необходимо досконально разобраться в сути данного процесса и понять, как именно меняется структура локонов после его проведения.

В настоящее время прекрасной половине человечества доступно множество самых разных способов эффективно изменить свою внешность.

Кератиновое выпрямление является современным способом, позволяющим по-настоящему качественно разгладить кудри и обеспечить их защитой от агрессивного внешнего воздействия.

Кроме этого данный способ обработки волос дает возможность восстановить поврежденные локоны.

Суть его заключается в том, что после нанесения на волосы специального состава, его компоненты проникают глубоко в структуру локонов и воздействуют на них изнутри.

После кератинового выпрямления на волосяном покрове образуется тончайшая защитная пленка, которая не позволяет проникать в волосы вредным элементам со стороны.

В этом случае красить локоны можно, но только тогда, когда состав хорошо впитается в каждый волосок в отдельности.

Для того чтобы красить волосы после кератинового выпрямления, необходимо учесть специфику изменений волосяного покрова, которые произошли с ним после процедуры.

Особенности выполнения процедуры

После кератинового выпрямления волосяной покров на голове несколько изменяется, главным образом, за счет того, что на его поверхности образуется тончайшая пленка.

Красить такие локоны следует определенными красящими составами, при этом учитывая определенную специфику.

Вообще, данная процедура проводится для того, чтобы не только выпрямить локоны, но и максимально их восстановить после самых разных повреждений.

Она проводится исключительно в косметических салонах, так как требует использования специальных составов, которые наносятся на волосы по специальной технологии.

Видео:

Грамотное, а главное, правильно выполненное кератирование, позволяет эффективно восстановить поврежденную структуру локонов, благодаря чему данный метод можно смело назвать лечебным.

После него волосы наливаются естественной красотой и становятся более упругими и по-настоящему здоровыми.

При желании одновременно с кератированием выполнить окрашивание волос, лучше это сделать тогда, когда локоны еще не будут подвержены обработке специальными кератирующими составами.

Между тем, при необходимости, красить волосы можно и после выполнения данной процедуры, но только через определенное время.

Волосы на голове после керативного выпрямления не изменяют свою структуру.

Восстановление поврежденных локонов происходит за счет того, что вещество в жидком состоянии проникает в пустоты и трещины каждого волоса в отдельности и плотно их заполняет.

Благодаря этому волосяной покров на голове приобретает естественную упругость и природную красоту.

Одним из главных достоинств кератинового выпрямления является то, что используемые при этом специальные средства не содержат в своем составе всевозможные химические консерванты и агрессивные добавки.

Кроме этого, кератин в жидком состоянии не отяжеляет локоны, что способствует более естественному виду прически.

Также стоит отметить и то, что после кератинового выпрямления волосяной покров на голове можно подвергать термической обработке и спокойно использовать разнообразные косметические средства для укладки.

Видео:

За счет данной процедуры волосы становятся менее подвержены всевозможным загрязнениям, а кроме этого, дольше сохраняют свой объем.

Данную процедуру можно проводить одновременно с окрашиванием, но только при условии выполнения некоторых определенных требований.

В этом случае следует использовать только натуральные краски, состав которых состоит преимущественно из природных компонентов.

Порядок проведения процедуры

Для керативного выпрямления можно обратиться в любой профессиональный косметический салон.

Мастер подробно разъяснит суть выполнения данной процедуры и ее последствия, кроме этого, расскажет, как лучше красить волосы.

Сама процедура начинается с тщательной подготовки локонов. Для начала волосы аккуратно расчесываются с использованием расчески с редкими зубьями.

После этого голову следует тщательно промыть при помощи специального шампуня, в состав которого должен обязательно входить кератин.

При нанесении моющего средства на волосы их следует массировать аккуратными массажными движениями и контролировать, чтобы средство равномерно покрыло всю площадь волосяного покрова.

Далее волосы промокают мягким полотенцем, тщательно расчесывают и оставляют сохнуть естественным способом. Когда локоны станут слегка влажными, на них следует нанести средство для выпрямления.

В этом случае следует внимательно контролировать, чтобы используемым средством был промазан каждый волосок в отдельности.

Проведение керативного выпрямления отнимает много времени, однако конечный результат того стоит.

После того, как состав для выпрямления хорошо впитается в структуру волос, их следует тщательно высушить и для этих целей необходимо использовать мощный фен.

Далее производится обработка прядей стайлером. Это делается, главным образом, для того, чтобы плотно запечатать жидкий кератин по всей длине волос, тем самым полностью восстановить их поврежденную структуру.

Видео:

Только после того, как будут проделаны все вышеперечисленные манипуляции, можно приступать к окончательному мытью головы.

Необходимо постараться вымыть из волосяного покрова все остатки вещества, которое по тем или иным причинам не впиталось.

Останется только высушить обработанные волосы и сделать это лучше всего естественным способом.

После кератинового выпрямления волосы приобретут естественный здоровый вид и насытятся природной энергией.

Кроме этого, на них будет образована специальная тончайшая пленка, которая обеспечит эффективную защиту от всевозможных агрессивных воздействий со стороны.

Красить волосы после проведения данной обработки следует с учетом специфических особенностей этого метода.

Правила окрашивания

Красить волосы после того, как было проведено кератиновое выпрямление можно, однако необходимо в этом случае руководствоваться некоторыми правилами.

Конечно, если есть возможность покрасить волосы до кератинового выпрямления, лучшей ей воспользоваться. Оптимальным вариантом является покраска кудрей за три дня до проведения обработки.

Видео:

В этом случае краска успеет хорошо впитаться в структуру кудрей и набраться яркости.

Кератиновое выпрямление поможет закрепить красящий состав на прядях, в результате чего они будут лучше сохранять желаемый оттенок, даже после различной обработки.

Какой краской в этом случае лучше пользоваться, ответить однозначно нельзя. Само по себе окрашивание — это своеобразный стресс для волос, при котором они теряют многие свои природные качества.

Краску следует выбирать ту, которая в своем составе содержит меньше химических красителей и агрессивных веществ.

Не стоит обращать внимание на те краски, которые даже в небольших количествах в своем составе содержат такой агрессивный компонент, как аммиак.

В этом случае после окрашивания кудри могут не только повредиться, но и начать чрезмерно выпадать.

В некотором смысле керативная обработка поможет несколько восстановить поврежденную структуру кудрей после воздействия краски.

Можно красить волосы на голове и после обработки кератином. В этом случае, конечно, эффект будет не столь ярким и впечатляющим, однако при использовании качественных красителей можно добиться приемлемого результата.

После кератинового выпрямления волосы лучше вообще не трогать и не подвергать их воздействию со стороны.

Видео:

Кератин должен хорошо зафиксироваться и проникнуть во внутреннюю структуру каждого волоса в отдельности.

После данной обработки красить локоны лучше через две недели, после того, как они привыкнут к своему новому состоянию.

После проведения кератиновой обработки, красить волосы рекомендуется в косметических салонах, где смогут подобрать наиболее оптимальные красители.

Следует помнить, что краска достаточно плохо держится на кератиновом покрытии, которое образуется на кудрях после проведения данной обработки.

При необходимости выполнить подкрашивание отросших корней, сделать это можно в любое время.

Вообще к покраске волос после выполнения кератинового выпрямления следует подходить ответственно и с полным пониманием дела.

В любом случае, после такой обработки краска хорошо ляжет на волосы только при соблюдении всех соответствующих рекомендаций и правил.

Вы здесь:

11460 Опубликовано 15 ноября 2015

Как сочетать процедуры? – Keratinstyle24

Кератин, ботокс и окрашивание

При процедуре кератин немного осветляет искусственную пигментацию, примерно на пол тона. Поэтому мы рекомендуем проводить окрашивание через 2 недели после кератина или наоборот.

Если клиент хочет объединить процедуры окрашивания и кератина, необходимо ему объяснить последствия. Кислотно -щелочная реакция окрашивания заканчивается через 2 суток, цвет может немного “съехать” и клиентка будет сокрушаться, что ей придется освежать окрашивание. Кроме того может упасть носкость кератина и вместо 3-6 месяцев (каждый раз индивидуально) носкость будет меньше. Пусть окончательное решение по объединению процедур будет за клиентом.

После кератинового выпрямления окрашивание прикорневой зоны, где нет кератина, проходит как всегда, а остальная длина (с кератином или ботоксом) только тонируется на маленьком проценте оксида 1,5 или 1,9

Коллагеновое обертывание и  окрашивание, стрижка, полировка волос.

Коллагеновое обертывание COLLAGEN GLOSS проводится:

После осветления волос, перед тонированием. После осветления коллаген заполнит волосы, придаст мягкость, легкость расчесывания, снимет статику. Коллаген не препятствует тонированию, оттенки выглядят глубокими и насыщенными.

После окрашивания. Коллаген облагораживает цвет, придает сияние волосам. Пигментация не меняется!

После стрижки. Коллаген разгладит волосы и облегчит укладку. Стрижка ложится так, как вы пожелаете.

Перед полировкой волос. Разглаживайте волосы коллагеном перед полировкой. Ухоженные волосы, без секущихся кончиков – мечта каждой девушки.

Отлично проходит процедура коллагенового обертывания сразу после окрашивания!

Подчеркивает цвет, и укладываются волосы легко – клиентка увидит рассыпчатые, не жирные волосы, переливающиеся в лучах света

Прикорневой объем волос и окрашивание.

Прикорневой объем выполняется составом для долговременной укладки. Волосы в прикорневой зоне становятся немного суше. Об этом всегда необходимо предупреждать.

Стабилизация химической процедуры 48 часов – поэтому тонировние шампунями, масками и краской на 1,5 или 1,9% оксиде возможно не раньше чем через 2 дня.

Окрашивание на 3 и 6% оксиде можно проводить уже через 7 дней

Использование осветляющего порошка в зоне процедуры – за 2 недели до или 2 недели после процедуры.

Исключить нанесение 9 и 12% оксидов в зоне прикорневого объема.

Прикорневой объем и кератин, ботокс, коллагеновое обертыавние

После проведения процедуры создания прикорневого объема очень хорошо делать коллагеновое обертывание, ботокс или кератин – на все волосы, кроме тех волос, которые участвовали в процедуре создания прикорневого объема. Для этого в теменной зоне (верхняя часть головы) надо отступить сантиметров 6-12 (индивидуально) , а всю остальную длину волос покрыть коллагеном, ботоксом или кератином.

Это очень популярное сочетание.

 

Окраска волос после кератинового выпрямления — преимущества и недостатки

Идеально ровные, блестящие, гладкие волосы который год в числе модных тенденций. Послушные и ухоженные локоны требуют тщательного ухода и регулярных укладок, что занимает немало времени. Альтернативой частым уходовым процедурам станет долгосрочная укладка – кератиновое выпрямление. Оно обеспечивает отличный результат на несколько месяцев, в течение которых можно забыть об утюжке. Но поскольку совершенству нет предела, девушки часто желают совместить окрашивание и кератирование. Проводится ли покраска после кератина и какие нюансы стоит учитывать в этом случае, речь пойдет ниже.

Преимущества кератинового выпрямления

Основным компонентом состава, которым обрабатывают волосы во время бразильского выпрямления, является кератин. Это природный белок, который входит в состав ногтей, волос, эпителия, обеспечивая прочность и жесткость. Его присутствие в локонах зависит от ДНК человека, что и определяет тип волос. При насыщении жидким кератином волосяного стержня обеспечивается прочность, твердость и упругость волоска.

Результаты кератинирования:

• Идеальное выравнивание локонов – как тугих завитков, так и прядей с небольшой волной;
• Абсолютная гладкость;
• Нейтрализация пушистости и статики при расчесывании, укладке;
• Увеличение плотности за счет образования защитной пленки вокруг волосков

Проникая внутрь столба волосков, природный белок заполняет все пустоты, изменяя природную структуру. Эффект держится до 5 месяцев, после чего вещество постепенно вымывается из волос. Купить кератин для проведения процедуры лучше по рекомендации мастера – только профессионал знает, какой состав оптимален для локонов вашего типа. Как совмещать окрашивание и кератирование, а также какая краска для волос лучше на кератин, разбираемся ниже.

Покраска после кератина – недостатки и преимущества

Кератин сразу после покраски делать не рекомендуется, хотя такая очередность вполне допускается мастерами. Профессионалы рекомендуют выдержать интервал в 1-2 недели между процедурами, после чего приходить на сеанс для выравнивания завитков.

В ряде случаев необходимо регулярно окрашивать волосы, в том числе и после кератина. Это связано с отрастанием седины на корнях и другими факторами. В данном случае также желательно сделать перерыв в пару-тройку недель между услугами, чтобы активные вещества кератинового состава впитались в волосы и не вступили в реакцию с пигментом, а также использовать безаммиачные средства.

Эффект окрашивания волос после кератина не всегда оправдывает ожидания, так как могут проявиться:

• Потеря плотности волоска;
• Сечение кончиков;
• Признаки сухости;
• Аллергические реакции;
• Перхоть.

Применяя кератин на светлый волос, стоит тщательно подбирать состав: это должна быть косметика щадящего действия, не повреждающая структуру натурального блонда.

Подробнее о плюсах и минусах кератина для волос читайте в нашем блоге.

Кератиновое выпрямление GREYMY (6 месяцев)

Всего за одну процедуру ваши волосы обретут идеальное состояние: станут гладкими, здоровыми и сияющими.Наномолекулы кератина с легкостью проникают в структуру, плотно заполняя все микротрещины и пустоты в поврежденных волосах.

Уникальная формула Greymy Professional Hair Keratin Treatment Cream питает структуру волос, поддерживая естественный уровень увлажнения и PH. За счет всего этого происходит естественное утяжеление волос и, как следствие, выпрямление волос.

Результат – шелковистые, блестящие и гладкие волосы. Эффект сохраняется от 3 до 6 месяцев.
Выпрямление, глубокое восстановление структуры и лечение волос!

Одна из самых прогрессивных в индустрии красоты, предназначенная не только для выпрямления и разглаживания волос, но и, прежде всего, для их лечения, и восстановления.

Принцип работы этой системы, это проникновение в самые микроскопические разрывы, пустоты, разрушенные белковые цепи и трещины волоса наномолекулы кератина и наполнение всей структуры поврежденного волоса кератином. В результате воздействия системы полностью восстанавливается структура и форма волоса.

По всей длине волосы обретают утраченную прочность, здоровье, гладкость, блеск и силу.

Как это работает?

Наномолекулярный кератин заполняет весь волос, благодаря мельчайшему размеру молекул и затем, после процедуры выпаривания, «запирается» внутри волоса. Крошечные частицы кератина проникают в структуру поврежденного волоса и остаются внутри, надежно обволакивая волос нерастворимым и несмываемым покрытием. Происходит реакция «полимеризации», превращающая волосы в эластичные, гибкие и прочные. При этом образуется нерастворимый, постоянный кератин, полностью соответствующий природному кератину. Волосы в результате процедуры выпрямления Greymy становятся не только прямыми, гладкими, блестящими и мягкими, как шелк, но и более здоровыми и прочными. После воздействия Greymy сделать укладку становится проще простого, волосы легко расчесываются и доставляют своему обладателю только приятные мгновения.

Результат:

• Здоровые, струящиеся, шелковистые волосы с потрясающим блеском
• На 6 месяцев!

Это нужно знать:

• Выпрямление волос Greymy подходит для любого типа волос.
• Пользуется успехом, как у женщин, так и у мужчин.
• Идеально использовать в день окрашивания волос: пролонгирует устойчивость цветового пигмента и подчеркивает его.
• После кератинового выпрямления волос окрашивание рекомендуется проводить не ранее, чем через 2 недели.

* Внимание

После проведения процедуры выпрямления Greymy обязательным условием для сохранения результата и длительности эффекта от процедуры в течение 6-ти мес. является использование Бриллиантовой маски и восстанавливающего шампуня.

Вопросы и ответы

Особенности ухода за волосами Greymy в сравнении с другими методами?

Уход, основанный на Нано кератинах, является настоящим прорывом в сфере восстановления и выпрямления волос. Метод использует наномолекулярный кератин, частицы которого настолько малы, что миллионы подобных частиц можно было бы разместить на булавочной головке! Частицы Нанокератина внедряются в поврежденные волосы, «запираются» в них, покрывают их естественным образом, восстанавливают волосы и способствуют их оздоровлению. При других методах ухода за волосами используются довольно крупные молекулы, не способные проникнуть в структуру волоса. Микроскопические молекулы Нанокератина проникают внутрь волоса и, таким образом, обеспечивают длительный благотворный эффект.

При каких типах волос допустим уход от Greymy?

Greymy подходит для волос, подвергшихся химической обработке, например, для окрашенных волос, волос с нанесёнными оттенками, для ломких и крайне тонких волос, а также для проблемных натуральных волос — чрезвычайно сеченых, сухих или «резиновых» волос. Greymy обладает весьма оздоравливающим воздействием на волосы.

Каким шампунем можно пользоваться после выпрямления волос от Greymy?

После выпрямления волос Greymy мы рекомендуем пользоваться шампунем Greymy, поскольку он содержит комплекс Кератин, специально подобранный для восстановления и построения волосяных волокон. В состав шампуня Кератин входит SLS – Натрий, удаляющий излишний слой Кератина.

Вопросы и ответы о кератиновом выпрямлении волос Brazilian Blowout

В. Как скоро я смогу повторить Brazilian Blowout после моей первой процедуры?
О. Brazilian Blowout – это средство для улучшения здоровья волос, избыток его не повредит волосам, однако надо помнить, что объем кутикул волос ограничен, заполнение их возможно только до определенного уровня. Если клиент хочет повторить процедуру или предыдущая процедура не взялась по какой-либо причине, то можно повторить ее через десять дней. Это минимальный промежуток между двумя процедурами.

В. Можно ли сравнивать кератиновое выпрямление (разглаживание) и ламинирование волос?
О. Кератирование и ламинирование — это две абсолютно разные процедуры, по разному воздействующие на волосы. Попробуем сопоставить несколько фактов о двух процедурах: — Ламинирование не выпрямляет, действует лишь на поверхности волоса, обволакивая его силиконами, создавая только внешнюю красоту. Можно сравнить ламинирование с окрашиванием, поскольку видна лишь визуальная разница между «До» и «После». Продолжительность действия процедуры 2-4 недели и не имеет накопительного эффекта. — Кератирование это в первую очередь оздоровительная процедура. В состав Brazilian Blowout входят кератин, аминокислоты и супер питательный комплекс с добавлением экстракта ягоды Асай, которые насыщают и питают волосы изнутри, делая волосы гладкими, шелковистыми, податливыми, убирая пушистость. Продолжительность действия кератиновой процедуры значительно дольше (до 12 недель) и имеет очевидный накопительный эффект.

В. Можно ли применять Brazilian Blowout на наращенных волосах?
О. Да, Brazilian Blowout прекрасно подходит для наращенных волос, как искусственных, так и натуральных. Лучший результат достигается, если стилист обработает прядки для наращивания отдельно, до того, как их закрепить на голове. Если стилист хочет применить Brazilian Blowout уже на наращенных волосах, то надо быть предельно осторожным при применении средства в области стыковки волос, поскольку средство действует как кондиционер и создает скольжение между наращенными волосами и настоящими. Если стилист отделит наращенные волосы от настоящих волос клиента, то он достигнет прекрасных результатов.

В. В чем разница между выпрямлением и разглаживанием волос?
О. Термины “распрямление” или “выпрямление” (straightening) волос существуют в лексиконе достаточно давно, и чаще всего используются как описание процесса химического воздействия на волосы. Термин “разглаживание” (smoothing) волос вошел в лексикон относительно недавно, после изобретения новых средств, проникающих в кутикулы волос, не меняя их природную структуру. Принципиальная разница в способе воздействия на волосы требует ввести новое слово.

В. Могу ли я пройти процедуру Brazilian Blowout, если мои волосы окрашенные или мелированные?
О. Да, Brazilian Blowout действительно улучшает здоровье окрашенных или мелированных волос, кондиционирует их, запечатывает кутикулу для защиты цвета волос, устраняет фризз (frizz — предохраняет от статического электричества), и обеспечивает волосам невероятный блеск.

В. Процедура Brazilian Blowout выпрямит мои волосы?
О. Если Ваши волосы волнистые, Бразилиан Блоаут сделает их здоровыми и выглядящими натурально прямыми. Если волосы очень кудрявые, средство уменьшит эффект статического электричества (фризз, frizz) и придаст волосам естественную волнистость. Если ваши волосы прямые, с эффектом статического электричества (фризз, frizz), это средство устранит этот эффект и придаст невероятный блеск волосам.

В. Как долго сохраняется эффект от процедуры Brazilian Blowout?
О. Бразилиан Блоаут сохранится в течение 10-12 недель, если после процедуры использовать линию последующего ухода Асай Brazilian Blowout. Brazilian Blowout обладает кумулятивным (накопительным свойством) действием. Чем большее количество процедур вы сделаете, тем здоровее будут волосы, и дольше будет длиться результат от обработки Brazilian Blowout.

В. Могу ли я пройти процедуру Brazilian Blowout сразу после химического выпрямления?
О. Да. Brazilian Blowout действительно еще лучше действует на химически обработанных волосах, а также помогает улучшить состояние волос посредством укрепления каждого волоска жизненно необходимыми аминокислотами. Brazilian Blowout великолепно себя зарекомендовал в ситуациях, когда клиент хочет отказать от химического выпрямления. Процедура сглаживает границу между уже выпрямленными и отросшими волосами, возвращает здоровье волосам и придает им естественный вид.

В. Мои волосы потеряют объем после процедуры Brazilian Blowout?
О. Нет, ваши волосы не потеряют объем после процедуры Brazilian Blowout. Ваши волосы будут оставаться с натуральным объемом и легко сохранят предыдущую укладку.

В. Вернутся ли мои волосы после процедуры Brazilian Blowout в свое первоначальное состояние?
О. Да, волосы вернутся в исходное состояние через 10-12 недель, однако, состояние волос будет лучше в результате укрепления и кондиционирования, вызванного природой этого продукта.

В. Можно ли красить волосы в тот же день, когда была сделана процедура Brazilian Blowout?
О. Да, однако их надо покрасить до обработки Brazilian Blowout. Если вы хотите покрасить волосы в цвет темного брюнета или в красный цвет, то покрасьте на одну ступень темнее, чем вам бы хотелось, поскольку обработка Бразилиан Блоаутом имеет эффект легкого осветления цвета волос.

В. Могу ли я плавать в бассейне или в океане после процедуры Brazilian Blowout?
О. Да, вы можете плавать и в бассейне, и в океане, однако его действие ослабевает, если вы плаваете постоянно. Мы рекомендуем нанести на волосы Асай сыворотку Brazilian Blowout Serum до того, как вы пойдете плавать. Сыворотка будет действовать в качестве защитного барьера, сохраняющего эффект Brazilian Blowout.

В. Когда я смогу красить волосы после процедуры Brazilian Blowout?
О. Вы должны подождать, по меньшей мере, две недели после процедуры Brazilian Blowout, поскольку цвет неэффективно держится на защитном протеиновом барьере, полученном после разглаживающей обработки. Если Вы нуждаетесь в подкрашивании отросших корней волос в периоде 10-12 недель (между двумя процедурами), то можно подкрасить корни, на которые не было нанесено средство. Но если Вы хотите осветлить волосы или полностью их перекрасить, то стилист должен быть уверен, что Вы применяли маску Brazilian Blowout не менее одного или двух раз в неделю для укрепления действия обработки на волосах.

В. Когда я смогу мыть голову после процедуры Brazilian Blowout?
О. Вы можете мыть волосы сразу после процедуры Brazilian Blowout, или как обычно. Обратите внимание, что стилист вымоет волосы прямо в салоне, и клиенту не нужно будет ждать 72 часа, чтобы увидеть эффект от сделанной процедуры, клиент не покупает кота в мешке.

В. У меня сильно поврежденные, обесцвеченные, сухие и ломкие волосы. Не повредит ли им жар утюга во время процедуры?
О. Это важно для каждого стилиста – оценить состояние волос своего клиента, понять, насколько здоровы волосы для обработки горячим утюжком. Если состояние волос вызывает сомнения, то рекомендуется снизить температуру с 230°С до приблизительно 200°С. Стилист должен будет сам определить подходящую температуру.

В. Чем Brazilian Blowout отличается от Японского выпрямления?
О. Японское выпрямление меняет фактическую структуру волос химическим способом. Оно делает волосы неестественно прямыми и не поддающимися укладке. Целостность волос нарушается, и достаточно нескольких процедур японского выпрямления, чтобы волосы стали выглядеть нездоровыми. После него кудрявые волосы нужно пожизненно выпрямлять или, в конце концов, просто отстричь. Brazilian Blowout лишен всех этих недостатков.

В. Для кого предназначено процедура Brazilian Blowout?
О. Исходя из нашего опыта, лучшие кандитаты для использования Brazilian Blowout – это те, у кого волосы сухие, ломкие, электризуются, или волосы после любой, травмирующей их, обработки. Мы выполняли процедуру на любых типах волос (длинных, коротких, тонких, толстых, кудрявых, прямых, пушистых, наэлектризованных и т.д.). А также на нарощенных волосах, и волосах, подвергшихся химическому выпрямлению. Теперь, имея большой опыт за плечами, мы пришли к выводу, что эта процедура идет на пользу любым волосам.

В. Могу ли я использовать Brazilian Blowout, если я беременна или в период кормления грудью?
О. Поскольку не было проведено никаких клинических исследований на этот счет, мы не рекомендуем использование Brazilian Blowout беременным и кормящим.

В. В чем проявляется эффект от процедуры Brazilian Blowout?
О. Волосы станут послушными, блестящими, без статического электричества (пушистость, наэлектризованность, фризз, frizz) и мягко спадающими. Время, затрачиваемое дома на укладку феном и утюжком, максимально сократится. Многие наши клиенты говорят, что по утрам им нужно всего лишь причесаться, чтобы вернуть укладку предыдущего дня. Вот что сказала одна из поклонниц Brazilian Blowout: “За день до отъезда на море сделала себе Brazilian Blowout и, по привычке, запаслась своим парикмахерским “багажом”. Скажу честно, что все две недели после моря и душа волосы даже не сушила, просто забыла что такое укладка, волосы высыхали, и укладка становилась как после салона. Весь “багаж” оказался обузой. Я в полном восторге!”

Сравнение специальных красителей на кератин с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином

J Int Oral Health. 2015 Март; 7 (3): 1–5.

Рупа С Рао

¹ Профессор и заведующий кафедрой патологии полости рта и микробиологии факультета стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Шанкаргуда Патил

² Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Барнали Маджумдар

³ Аспирант, Отделение оральной патологии и микробиологии, Факультет стоматологических наук, М.С. Рамайя Университет прикладных наук, Бангалор, Карнатака, Индия

Ракеш Г. Освал

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница Массачусетса Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

¹ Профессор и руководитель Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая S наук, Бангалор, Карнатака, Индия

² Доцент, кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

³ Аспирант, кафедра орального Патология и микробиология, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница MA Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

Адрес для корреспонденции: Dr.Патил С. Кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М. С. Рамая, Почта технологического института М. С. Рамая, М. С. Рамаяй Нагар, Бангалор — 560 054, Карнатака, Индия. Электронная почта: moc.liamg@2161litapbs

Поступила 12 мая 2014 г .; Принято 13 августа 2014 г.

Авторские права: © Journal of International Oral Health

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любых средний при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Предпосылки:

Кератины являются наиболее распространенными белками и являются характерным признаком многих эпителиальных патологий, что делает их диагностически важным маркером, как гистопатологически, так и иммуногистохимически. Поскольку иммуногистохимия — это дорогостоящий диагностический инструмент, специальные пятна для определения степени ороговения могут служить более быстрым и экономичным вариантом. Целью настоящего исследования было сравнить эффективность специальных красителей для кератина со стандартными красителями гематоксилином и эозином (H и E).Цели включают: (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным окрашивателям: метод Аюб-шкала, метод Дейна-Германа, Альциановый синий –периодная кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму. . (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином (H и E). (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы:

Всего из архива отделения было извлечено 80 случаев известной патологии кератина, в том числе по 10 случаев нормальной десны, гиперкератоза, плоской папилломы, бородавчатой ​​гиперплазии, бородавчатой ​​карциномы, хорошо дифференцированной плоскоклеточной карциномы. , ортокератинизированные одонтогенные кисты и керато-кистозные одонтогенные опухоли. Были сделаны шесть срезов по 4 мкм каждый из парафиновых блоков, окрашенных H и E и специальными красителями, и они были оценены двумя патологами на основе модифицированных критериев оценки от Rahma Al-Maaini и Philip Bryant 2008.

Результаты:

Результаты были сведены в таблицу с использованием статистики хи-квадрат и каппа. Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным пятнам. Кроме того, все специальные окрашивания показали положительный результат и статистическую значимость (P <0,001) в отношении окрашивания кератина.

Заключение:

В заключение, хотя специальные пятна отчетливо окрашивали кератин с более высокой интенсивностью, H и E оказались в целом лучше по специфичности

Ключевые слова: Кератины, Ayoub-Shklar, Dane-Herman , alcian blue-period acid schiff, PAP, грамм

Введение

Кератины являются одним из основных и ключевых структурных белков, обнаруживаемых в самых высоких концентрациях и разнообразии в кератиноцитах кожного и орального эпителия, и на их долю приходится почти 80% от общего содержания белка в дифференцированных клетках многослойного эпителия.В 1900-х годах кератины считались белками, которые можно было извлекать из различных эпидермальных модификаций животных, таких как шерсть, рога, когти и т. Д. 1,2. Впоследствии, с развитием исследований и появлением 21 ^-го -го века. В настоящее время кератины (цитокератины) считаются белками промежуточных филаментов с определенными физико-химическими свойствами, обнаруженными в эпителии любого позвоночного. типы эпителия, а также разные слои единого многослойного эпителия.Основная функция цитокератинов, наряду с микротрубочками и микрофиламентами, заключается в обеспечении структурной целостности и механической устойчивости всех эукариотических клеток. наличие или отсутствие ороговения. Кератинизация или ороговение включает процесс цитодифференцировки кератиноцитов, начиная с их постформационного состояния, т.е.e., stratum basale до конечного дифференцированного состояния упрочненных ороговевших клеток, заполненных кератиновыми филаментами, обнаруженными в поверхностном слое, то есть в роговом слое.4

Широкий спектр наследственных, предраковых и злокачественных заболеваний возникает из-за дефектов в процессе кератинизации превращение кератиновых белков в важный диагностический инструмент. 4 Следовательно, одна из важных областей применения кератинов — это диагностика эпителиальных патологий. Хотя иммуногистохимия известна своей специфичностью в диагностике, она не является предпочтительным выбором из-за ее стоимости и затрат времени.Гематоксилин и эозин (H и E), обычные красители, не различают четко различные эозинофильные компоненты соединительной ткани, с другой стороны, специальные красители могут оказаться простым и экономичным решением для гистологического определения наличия и структуры кератина. .

В настоящем исследовании метод окрашивания по методу Аюб-Шклар (AS), метод Дейна-Германа (DH), Альциановый синий (AB) –периодическая кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание по Папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму сравнивались с обычным H и окрашивание E в отношении качества окрашивания и способности идентифицировать кератин.5

Цель и задачи

Целью настоящего исследования было сравнение эффективности специальных красителей для кератина со стандартными красителями H и E.

Цели исследования включают:

• (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным пятнам: метод A-S, метод D-H, AB-PAS, быстрое PAP и окрашивание по Граму.
• (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием H и E.
• (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы

Выбор случая и процедура настоящего исследования изображены на и соответственно.

Выбор случая и порядок действий.

Таблица 1

Критерии, выбранные для оценки пятен9

Процедура окрашивания для окрашивания A-S была взята из Ramulu et al., краситель Дейн-Герман от Дейна и Германа и другие красители от Bancroft and Gamble. 5-7 Процедура AB -PAS была модифицирована от Скотта и Клейтона следующим образом: 8

1. Депарафинизируйте и гидратируйте срезы ткани дистиллированной воды.

2. Пятно в AB в течение 30 мин. Стирать в воде 5 мин.

3. Окисляют в подкисленном перманганате (равные части 0,5% перманганата калия и 0,5% серной кислоты) в течение 5 минут, промывают 2% щавелевой кислотой в течение 30 секунд и промывают водой в течение 5 минут.

4. Окрашивают в реактиве Шиффа в течение 15 минут и промывают водой в течение 10 минут.

5. Окрашивают гематоксилином Майера в течение 3 минут и промывают водой в течение 5 минут.

6. Обезвожить, очистить ксилолом и закрепить.

Статистический анализ

Результаты были сведены в таблицу с использованием критерия хи-квадрат и статистики каппа для вариаций между наблюдателями.

Результаты

Микрофотография кератина, окрашенного H и E, и специальных пятен представлена ​​на.В настоящем исследовании все специальные окрашивания показали положительные и статистически значимые ( P <0,001) результаты в отношении окрашивания кератина.

Микрофотография кератина, окрашенного H и E и различными специальными красителями (увеличение: 10 ×) (NG: нормальная десна, H: гиперкератоз, SP: плоская папиллома, VH: веррукозная гиперплазия, VCA: веррукозная карцинома, CA: хорошо дифференцированная плоскоклеточный рак, OOC: ортокератинизированные одонтогенные кисты, KCOT: керато-кистозная одонтогенная опухоль, H и E: гематоксилин и эозин, AS: метод Аюб-шкала, DH: метод Дейна-Германа, AB-PAS: периодическая кислота Альциана синего Шиффа, PAP : Быстрое окрашивание по Папаниколау и Граму).

Среди специальных красителей была обнаружена более высокая специфичность окрашивания методом D-H, за которым следуют A-S, AB-PAS, PAP и Грама (). Что касается интенсивности окрашивания, было обнаружено, что метод A-S был выше, за ним следуют AB -PAS, метод D-H, PAP и метод Грама (). В целом, специфичность и интенсивность окрашивания H и E оказались самыми высокими по сравнению со всеми специальными красителями.

Таблица 2

Статистические значения специфичности окрашивания.

Таблица 3

Статистические значения интенсивности окрашивания.

Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным красителям ().

Таблица 4

Статистическое значение для идентификации типа кератина.

Значение Каппа 0,57–0,60 предполагает удовлетворительное или умеренное согласие между наблюдателями.

Обсуждение

Специальные красители — это нестандартные красители, которые могут дифференцировать определенные клетки, компоненты тканей и микроорганизмы при нанесении на гистопатологические или цитологические препараты.Для выделения и выделения небольших очагов аномального ороговения показаны специальные красители для кератина.

Кератин состоит из нерастворимых белков, которые, в свою очередь, состоят из аминокислот с высоким содержанием сульфгидрила и дисульфида, поэтому его можно продемонстрировать гистохимическими методами аминокислот, такими как метод AB. Кроме того, кератин можно продемонстрировать с помощью реактива Шиффа после окисления перманганатом. Окисление, вероятно, приводит к образованию сильного окислителя небольших количеств альдегидных групп из некоторых составляющих кератинового белка.В настоящем исследовании вместо периодной кислоты для окисления использовался подкисленный раствор перманганата, что улучшило качество окрашивания комбинированного метода AB и PAS.8 Комбинированный метод AB и PAS окрашивает ткани, содержащие как нейтральные, так и кислые муцины в различные оттенки пурпурного.5,10

Кератины также ярко окрашиваются от красного и оранжевого до пурпурного оттенков, соответственно, флоксином, компонентом метода DH, и оранжевым красителем G, компонентом как окрашивания AS, так и PAP5,11 Кератин, а также как гранулы кератохилина, также являются умеренно грамположительными.5

В настоящем исследовании срезы орто- и паракератинизированной нормальной десны были одинаково различимы всеми специальными пятнами по сравнению с H и E. Что касается отдельных случаев, содержание кератина в просвете, а также тип ороговевшего эпителия ортокератинизированной одонтогенной кисты лучше наблюдались при использовании метода DH и AS (как специфичность, так и интенсивность были выше), чем при использовании H и E. керато-кистозные одонтогенные опухоли.

Закупорка паракератина в бородавчатой ​​карциноме и поверхностный кератин плоской папилломы и бородавчатой ​​гиперплазии лучше окрашивались по интенсивности с помощью DH, AS и AB -PAS, в свою очередь, с последующим окрашиванием по PAP и Граму, но в отношении специфичности Было обнаружено, что окраска H и E является более подходящей.

Однако не все кератиновые жемчужины, присутствующие в хорошо дифференцированных срезах ткани плоскоклеточной карциномы, могут быть положительно окрашены специальными красителями по сравнению с H и E, возможное объяснение состоит в том, что кератиновые жемчужины, положительно окрашенные специальными красителями, подверглись бы нормальному окрашиванию. Процесс созревания аналогичен физиологическому кератину, тогда как неокрашенные кератиновые жемчужины могут иметь определенные неизвестные биохимические различия в процессе созревания, что делает их менее реактивными к особым пятнам.6

Заключение

В настоящем исследовании среди всех специальных красителей D-H, A-S и AB-PAS продемонстрировали общее качество окрашивания, сопоставимое с H и E, что позволяет предположить их потенциальное использование в качестве альтернативных красителей для кератина. Кроме того, все специальные красители смогли успешно идентифицировать тип кератинизации и отчетливо окрашивать кератин, отличая его от других компонентов соединительной ткани с более высокой интенсивностью, однако H и E показали более высокую специфичность в целом.

Сноски

Конфликт интересов: нет

Источник поддержки: нет

Ссылки

2. Bragulla HH, Homberger DG. Структура и функции белков кератина в простом, многослойном, ороговевшем и ороговевшем эпителии. J Anat. 2009. 214 (4): 516–59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Гистология полости рта Нанси А. Тен Кейт: развитие, структура и функция. 8-е изд. Миссури, США: Мосби Эльзевьер; 2012 г.[Google Scholar] 5. Бэнкрофт Дж. Д., Гэмбл М. Теория и практика гистологических методов. 6-е изд. Филадельфия: Черчилль Ливингстон Эльзевьер; 2008. [Google Scholar] 6. Рамулу С., Кале А.Д., Халликеримат С., Котрашетти В. Сравнение модифицированного окрашивания папаниколау с окрашиванием айуб-шкларом и гематоксилин-эозином для демонстрации кератина в срезах ткани, залитых парафином. J Oral Maxillofac Pathol. 2013. 17 (1): 23–30. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Датчанин Е.Т., Герман Д.Л. Дифференциальное окрашивание прекератина, кератина и муцина гематоксилином-флоксином-альцианом сине-оранжевым G.Stain Technol. 1963; 38: 97–101. [PubMed] [Google Scholar] 8. Скотт HR, Clayton BP. Сравнение сродства к окрашиванию альдегид-фуксина и реактива Шиффа. J Histochem Cytochem. 1953; 1 (5): 336–52. [PubMed] [Google Scholar] 9. AI-Maaini R, Bryant P. Honey как альтернатива формалину в демонстрации компонентов соединительной ткани. J Histotechnol. 2008. 31 (2): 67–72. [Google Scholar] 10. Prunieras M. PAB: Ценный краситель для соединительной ткани, кератина и грибков. J Invest Dermatol. 1960; 35: 309–14.[PubMed] [Google Scholar] 11. Карсон Флорида, Криста Х. Гистотехнология: текст для самообучения. 3-е изд. Гонконг: Американское общество клинической патологии; 2009. [Google Scholar]

Сравнение специальных красителей для кератина с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином

J Int Oral Health. 2015 Март; 7 (3): 1–5.

Рупа С Рао

¹ Профессор и заведующий кафедрой патологии полости рта и микробиологии факультета стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Шанкаргуда Патил

² Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Барнали Маджумдар

³ Аспирант, Отделение оральной патологии и микробиологии, Факультет стоматологических наук, М.С. Рамайя Университет прикладных наук, Бангалор, Карнатака, Индия

Ракеш Г. Освал

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница Массачусетса Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

¹ Профессор и руководитель Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая S наук, Бангалор, Карнатака, Индия

² Доцент, кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

³ Аспирант, кафедра орального Патология и микробиология, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница MA Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

Адрес для корреспонденции: Dr.Патил С. Кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М. С. Рамая, Почта технологического института М. С. Рамая, М. С. Рамаяй Нагар, Бангалор — 560 054, Карнатака, Индия. Электронная почта: moc.liamg@2161litapbs

Поступила 12 мая 2014 г .; Принято 13 августа 2014 г.

Авторские права: © Journal of International Oral Health

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любых средний при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Предпосылки:

Кератины являются наиболее распространенными белками и являются характерным признаком многих эпителиальных патологий, что делает их диагностически важным маркером, как гистопатологически, так и иммуногистохимически. Поскольку иммуногистохимия — это дорогостоящий диагностический инструмент, специальные пятна для определения степени ороговения могут служить более быстрым и экономичным вариантом. Целью настоящего исследования было сравнить эффективность специальных красителей для кератина со стандартными красителями гематоксилином и эозином (H и E).Цели включают: (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным окрашивателям: метод Аюб-шкала, метод Дейна-Германа, Альциановый синий –периодная кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму. . (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином (H и E). (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы:

Всего из архива отделения было извлечено 80 случаев известной патологии кератина, в том числе по 10 случаев нормальной десны, гиперкератоза, плоской папилломы, бородавчатой ​​гиперплазии, бородавчатой ​​карциномы, хорошо дифференцированной плоскоклеточной карциномы. , ортокератинизированные одонтогенные кисты и керато-кистозные одонтогенные опухоли. Были сделаны шесть срезов по 4 мкм каждый из парафиновых блоков, окрашенных H и E и специальными красителями, и они были оценены двумя патологами на основе модифицированных критериев оценки от Rahma Al-Maaini и Philip Bryant 2008.

Результаты:

Результаты были сведены в таблицу с использованием статистики хи-квадрат и каппа. Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным пятнам. Кроме того, все специальные окрашивания показали положительный результат и статистическую значимость (P <0,001) в отношении окрашивания кератина.

Заключение:

В заключение, хотя специальные пятна отчетливо окрашивали кератин с более высокой интенсивностью, H и E оказались в целом лучше по специфичности

Ключевые слова: Кератины, Ayoub-Shklar, Dane-Herman , alcian blue-period acid schiff, PAP, грамм

Введение

Кератины являются одним из основных и ключевых структурных белков, обнаруживаемых в самых высоких концентрациях и разнообразии в кератиноцитах кожного и орального эпителия, и на их долю приходится почти 80% от общего содержания белка в дифференцированных клетках многослойного эпителия.В 1900-х годах кератины считались белками, которые можно было извлекать из различных эпидермальных модификаций животных, таких как шерсть, рога, когти и т. Д. 1,2. Впоследствии, с развитием исследований и появлением 21 ^-го -го века. В настоящее время кератины (цитокератины) считаются белками промежуточных филаментов с определенными физико-химическими свойствами, обнаруженными в эпителии любого позвоночного. типы эпителия, а также разные слои единого многослойного эпителия.Основная функция цитокератинов, наряду с микротрубочками и микрофиламентами, заключается в обеспечении структурной целостности и механической устойчивости всех эукариотических клеток. наличие или отсутствие ороговения. Кератинизация или ороговение включает процесс цитодифференцировки кератиноцитов, начиная с их постформационного состояния, т.е.e., stratum basale до конечного дифференцированного состояния упрочненных ороговевших клеток, заполненных кератиновыми филаментами, обнаруженными в поверхностном слое, то есть в роговом слое.4

Широкий спектр наследственных, предраковых и злокачественных заболеваний возникает из-за дефектов в процессе кератинизации превращение кератиновых белков в важный диагностический инструмент. 4 Следовательно, одна из важных областей применения кератинов — это диагностика эпителиальных патологий. Хотя иммуногистохимия известна своей специфичностью в диагностике, она не является предпочтительным выбором из-за ее стоимости и затрат времени.Гематоксилин и эозин (H и E), обычные красители, не различают четко различные эозинофильные компоненты соединительной ткани, с другой стороны, специальные красители могут оказаться простым и экономичным решением для гистологического определения наличия и структуры кератина. .

В настоящем исследовании метод окрашивания по методу Аюб-Шклар (AS), метод Дейна-Германа (DH), Альциановый синий (AB) –периодическая кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание по Папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму сравнивались с обычным H и окрашивание E в отношении качества окрашивания и способности идентифицировать кератин.5

Цель и задачи

Целью настоящего исследования было сравнение эффективности специальных красителей для кератина со стандартными красителями H и E.

Цели исследования включают:

• (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным пятнам: метод A-S, метод D-H, AB-PAS, быстрое PAP и окрашивание по Граму.
• (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием H и E.
• (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы

Выбор случая и процедура настоящего исследования изображены на и соответственно.

Выбор случая и порядок действий.

Таблица 1

Критерии, выбранные для оценки пятен9

Процедура окрашивания для окрашивания A-S была взята из Ramulu et al., краситель Дейн-Герман от Дейна и Германа и другие красители от Bancroft and Gamble. 5-7 Процедура AB -PAS была модифицирована от Скотта и Клейтона следующим образом: 8

1. Депарафинизируйте и гидратируйте срезы ткани дистиллированной воды.

2. Пятно в AB в течение 30 мин. Стирать в воде 5 мин.

3. Окисляют в подкисленном перманганате (равные части 0,5% перманганата калия и 0,5% серной кислоты) в течение 5 минут, промывают 2% щавелевой кислотой в течение 30 секунд и промывают водой в течение 5 минут.

4. Окрашивают в реактиве Шиффа в течение 15 минут и промывают водой в течение 10 минут.

5. Окрашивают гематоксилином Майера в течение 3 минут и промывают водой в течение 5 минут.

6. Обезвожить, очистить ксилолом и закрепить.

Статистический анализ

Результаты были сведены в таблицу с использованием критерия хи-квадрат и статистики каппа для вариаций между наблюдателями.

Результаты

Микрофотография кератина, окрашенного H и E, и специальных пятен представлена ​​на.В настоящем исследовании все специальные окрашивания показали положительные и статистически значимые ( P <0,001) результаты в отношении окрашивания кератина.

Микрофотография кератина, окрашенного H и E и различными специальными красителями (увеличение: 10 ×) (NG: нормальная десна, H: гиперкератоз, SP: плоская папиллома, VH: веррукозная гиперплазия, VCA: веррукозная карцинома, CA: хорошо дифференцированная плоскоклеточный рак, OOC: ортокератинизированные одонтогенные кисты, KCOT: керато-кистозная одонтогенная опухоль, H и E: гематоксилин и эозин, AS: метод Аюб-шкала, DH: метод Дейна-Германа, AB-PAS: периодическая кислота Альциана синего Шиффа, PAP : Быстрое окрашивание по Папаниколау и Граму).

Среди специальных красителей была обнаружена более высокая специфичность окрашивания методом D-H, за которым следуют A-S, AB-PAS, PAP и Грама (). Что касается интенсивности окрашивания, было обнаружено, что метод A-S был выше, за ним следуют AB -PAS, метод D-H, PAP и метод Грама (). В целом, специфичность и интенсивность окрашивания H и E оказались самыми высокими по сравнению со всеми специальными красителями.

Таблица 2

Статистические значения специфичности окрашивания.

Таблица 3

Статистические значения интенсивности окрашивания.

Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным красителям ().

Таблица 4

Статистическое значение для идентификации типа кератина.

Значение Каппа 0,57–0,60 предполагает удовлетворительное или умеренное согласие между наблюдателями.

Обсуждение

Специальные красители — это нестандартные красители, которые могут дифференцировать определенные клетки, компоненты тканей и микроорганизмы при нанесении на гистопатологические или цитологические препараты.Для выделения и выделения небольших очагов аномального ороговения показаны специальные красители для кератина.

Кератин состоит из нерастворимых белков, которые, в свою очередь, состоят из аминокислот с высоким содержанием сульфгидрила и дисульфида, поэтому его можно продемонстрировать гистохимическими методами аминокислот, такими как метод AB. Кроме того, кератин можно продемонстрировать с помощью реактива Шиффа после окисления перманганатом. Окисление, вероятно, приводит к образованию сильного окислителя небольших количеств альдегидных групп из некоторых составляющих кератинового белка.В настоящем исследовании вместо периодной кислоты для окисления использовался подкисленный раствор перманганата, что улучшило качество окрашивания комбинированного метода AB и PAS.8 Комбинированный метод AB и PAS окрашивает ткани, содержащие как нейтральные, так и кислые муцины в различные оттенки пурпурного.5,10

Кератины также ярко окрашиваются от красного и оранжевого до пурпурного оттенков, соответственно, флоксином, компонентом метода DH, и оранжевым красителем G, компонентом как окрашивания AS, так и PAP5,11 Кератин, а также как гранулы кератохилина, также являются умеренно грамположительными.5

В настоящем исследовании срезы орто- и паракератинизированной нормальной десны были одинаково различимы всеми специальными пятнами по сравнению с H и E. Что касается отдельных случаев, содержание кератина в просвете, а также тип ороговевшего эпителия ортокератинизированной одонтогенной кисты лучше наблюдались при использовании метода DH и AS (как специфичность, так и интенсивность были выше), чем при использовании H и E. керато-кистозные одонтогенные опухоли.

Закупорка паракератина в бородавчатой ​​карциноме и поверхностный кератин плоской папилломы и бородавчатой ​​гиперплазии лучше окрашивались по интенсивности с помощью DH, AS и AB -PAS, в свою очередь, с последующим окрашиванием по PAP и Граму, но в отношении специфичности Было обнаружено, что окраска H и E является более подходящей.

Однако не все кератиновые жемчужины, присутствующие в хорошо дифференцированных срезах ткани плоскоклеточной карциномы, могут быть положительно окрашены специальными красителями по сравнению с H и E, возможное объяснение состоит в том, что кератиновые жемчужины, положительно окрашенные специальными красителями, подверглись бы нормальному окрашиванию. Процесс созревания аналогичен физиологическому кератину, тогда как неокрашенные кератиновые жемчужины могут иметь определенные неизвестные биохимические различия в процессе созревания, что делает их менее реактивными к особым пятнам.6

Заключение

В настоящем исследовании среди всех специальных красителей D-H, A-S и AB-PAS продемонстрировали общее качество окрашивания, сопоставимое с H и E, что позволяет предположить их потенциальное использование в качестве альтернативных красителей для кератина. Кроме того, все специальные красители смогли успешно идентифицировать тип кератинизации и отчетливо окрашивать кератин, отличая его от других компонентов соединительной ткани с более высокой интенсивностью, однако H и E показали более высокую специфичность в целом.

Сноски

Конфликт интересов: нет

Источник поддержки: нет

Ссылки

2. Bragulla HH, Homberger DG. Структура и функции белков кератина в простом, многослойном, ороговевшем и ороговевшем эпителии. J Anat. 2009. 214 (4): 516–59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Гистология полости рта Нанси А. Тен Кейт: развитие, структура и функция. 8-е изд. Миссури, США: Мосби Эльзевьер; 2012 г.[Google Scholar] 5. Бэнкрофт Дж. Д., Гэмбл М. Теория и практика гистологических методов. 6-е изд. Филадельфия: Черчилль Ливингстон Эльзевьер; 2008. [Google Scholar] 6. Рамулу С., Кале А.Д., Халликеримат С., Котрашетти В. Сравнение модифицированного окрашивания папаниколау с окрашиванием айуб-шкларом и гематоксилин-эозином для демонстрации кератина в срезах ткани, залитых парафином. J Oral Maxillofac Pathol. 2013. 17 (1): 23–30. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Датчанин Е.Т., Герман Д.Л. Дифференциальное окрашивание прекератина, кератина и муцина гематоксилином-флоксином-альцианом сине-оранжевым G.Stain Technol. 1963; 38: 97–101. [PubMed] [Google Scholar] 8. Скотт HR, Clayton BP. Сравнение сродства к окрашиванию альдегид-фуксина и реактива Шиффа. J Histochem Cytochem. 1953; 1 (5): 336–52. [PubMed] [Google Scholar] 9. AI-Maaini R, Bryant P. Honey как альтернатива формалину в демонстрации компонентов соединительной ткани. J Histotechnol. 2008. 31 (2): 67–72. [Google Scholar] 10. Prunieras M. PAB: Ценный краситель для соединительной ткани, кератина и грибков. J Invest Dermatol. 1960; 35: 309–14.[PubMed] [Google Scholar] 11. Карсон Флорида, Криста Х. Гистотехнология: текст для самообучения. 3-е изд. Гонконг: Американское общество клинической патологии; 2009. [Google Scholar]

Сравнение специальных красителей для кератина с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином

J Int Oral Health. 2015 Март; 7 (3): 1–5.

Рупа С Рао

¹ Профессор и заведующий кафедрой патологии полости рта и микробиологии факультета стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Шанкаргуда Патил

² Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Барнали Маджумдар

³ Аспирант, Отделение оральной патологии и микробиологии, Факультет стоматологических наук, М.С. Рамайя Университет прикладных наук, Бангалор, Карнатака, Индия

Ракеш Г. Освал

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница Массачусетса Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

¹ Профессор и руководитель Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая S наук, Бангалор, Карнатака, Индия

² Доцент, кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

³ Аспирант, кафедра орального Патология и микробиология, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница MA Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

Адрес для корреспонденции: Dr.Патил С. Кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М. С. Рамая, Почта технологического института М. С. Рамая, М. С. Рамаяй Нагар, Бангалор — 560 054, Карнатака, Индия. Электронная почта: moc.liamg@2161litapbs

Поступила 12 мая 2014 г .; Принято 13 августа 2014 г.

Авторские права: © Journal of International Oral Health

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любых средний при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Предпосылки:

Кератины являются наиболее распространенными белками и являются характерным признаком многих эпителиальных патологий, что делает их диагностически важным маркером, как гистопатологически, так и иммуногистохимически. Поскольку иммуногистохимия — это дорогостоящий диагностический инструмент, специальные пятна для определения степени ороговения могут служить более быстрым и экономичным вариантом. Целью настоящего исследования было сравнить эффективность специальных красителей для кератина со стандартными красителями гематоксилином и эозином (H и E).Цели включают: (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным окрашивателям: метод Аюб-шкала, метод Дейна-Германа, Альциановый синий –периодная кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму. . (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином (H и E). (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы:

Всего из архива отделения было извлечено 80 случаев известной патологии кератина, в том числе по 10 случаев нормальной десны, гиперкератоза, плоской папилломы, бородавчатой ​​гиперплазии, бородавчатой ​​карциномы, хорошо дифференцированной плоскоклеточной карциномы. , ортокератинизированные одонтогенные кисты и керато-кистозные одонтогенные опухоли. Были сделаны шесть срезов по 4 мкм каждый из парафиновых блоков, окрашенных H и E и специальными красителями, и они были оценены двумя патологами на основе модифицированных критериев оценки от Rahma Al-Maaini и Philip Bryant 2008.

Результаты:

Результаты были сведены в таблицу с использованием статистики хи-квадрат и каппа. Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным пятнам. Кроме того, все специальные окрашивания показали положительный результат и статистическую значимость (P <0,001) в отношении окрашивания кератина.

Заключение:

В заключение, хотя специальные пятна отчетливо окрашивали кератин с более высокой интенсивностью, H и E оказались в целом лучше по специфичности

Ключевые слова: Кератины, Ayoub-Shklar, Dane-Herman , alcian blue-period acid schiff, PAP, грамм

Введение

Кератины являются одним из основных и ключевых структурных белков, обнаруживаемых в самых высоких концентрациях и разнообразии в кератиноцитах кожного и орального эпителия, и на их долю приходится почти 80% от общего содержания белка в дифференцированных клетках многослойного эпителия.В 1900-х годах кератины считались белками, которые можно было извлекать из различных эпидермальных модификаций животных, таких как шерсть, рога, когти и т. Д. 1,2. Впоследствии, с развитием исследований и появлением 21 ^-го -го века. В настоящее время кератины (цитокератины) считаются белками промежуточных филаментов с определенными физико-химическими свойствами, обнаруженными в эпителии любого позвоночного. типы эпителия, а также разные слои единого многослойного эпителия.Основная функция цитокератинов, наряду с микротрубочками и микрофиламентами, заключается в обеспечении структурной целостности и механической устойчивости всех эукариотических клеток. наличие или отсутствие ороговения. Кератинизация или ороговение включает процесс цитодифференцировки кератиноцитов, начиная с их постформационного состояния, т.е.e., stratum basale до конечного дифференцированного состояния упрочненных ороговевших клеток, заполненных кератиновыми филаментами, обнаруженными в поверхностном слое, то есть в роговом слое.4

Широкий спектр наследственных, предраковых и злокачественных заболеваний возникает из-за дефектов в процессе кератинизации превращение кератиновых белков в важный диагностический инструмент. 4 Следовательно, одна из важных областей применения кератинов — это диагностика эпителиальных патологий. Хотя иммуногистохимия известна своей специфичностью в диагностике, она не является предпочтительным выбором из-за ее стоимости и затрат времени.Гематоксилин и эозин (H и E), обычные красители, не различают четко различные эозинофильные компоненты соединительной ткани, с другой стороны, специальные красители могут оказаться простым и экономичным решением для гистологического определения наличия и структуры кератина. .

В настоящем исследовании метод окрашивания по методу Аюб-Шклар (AS), метод Дейна-Германа (DH), Альциановый синий (AB) –периодическая кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание по Папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму сравнивались с обычным H и окрашивание E в отношении качества окрашивания и способности идентифицировать кератин.5

Цель и задачи

Целью настоящего исследования было сравнение эффективности специальных красителей для кератина со стандартными красителями H и E.

Цели исследования включают:

• (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным пятнам: метод A-S, метод D-H, AB-PAS, быстрое PAP и окрашивание по Граму.
• (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием H и E.
• (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы

Выбор случая и процедура настоящего исследования изображены на и соответственно.

Выбор случая и порядок действий.

Таблица 1

Критерии, выбранные для оценки пятен9

Процедура окрашивания для окрашивания A-S была взята из Ramulu et al., краситель Дейн-Герман от Дейна и Германа и другие красители от Bancroft and Gamble. 5-7 Процедура AB -PAS была модифицирована от Скотта и Клейтона следующим образом: 8

1. Депарафинизируйте и гидратируйте срезы ткани дистиллированной воды.

2. Пятно в AB в течение 30 мин. Стирать в воде 5 мин.

3. Окисляют в подкисленном перманганате (равные части 0,5% перманганата калия и 0,5% серной кислоты) в течение 5 минут, промывают 2% щавелевой кислотой в течение 30 секунд и промывают водой в течение 5 минут.

4. Окрашивают в реактиве Шиффа в течение 15 минут и промывают водой в течение 10 минут.

5. Окрашивают гематоксилином Майера в течение 3 минут и промывают водой в течение 5 минут.

6. Обезвожить, очистить ксилолом и закрепить.

Статистический анализ

Результаты были сведены в таблицу с использованием критерия хи-квадрат и статистики каппа для вариаций между наблюдателями.

Результаты

Микрофотография кератина, окрашенного H и E, и специальных пятен представлена ​​на.В настоящем исследовании все специальные окрашивания показали положительные и статистически значимые ( P <0,001) результаты в отношении окрашивания кератина.

Микрофотография кератина, окрашенного H и E и различными специальными красителями (увеличение: 10 ×) (NG: нормальная десна, H: гиперкератоз, SP: плоская папиллома, VH: веррукозная гиперплазия, VCA: веррукозная карцинома, CA: хорошо дифференцированная плоскоклеточный рак, OOC: ортокератинизированные одонтогенные кисты, KCOT: керато-кистозная одонтогенная опухоль, H и E: гематоксилин и эозин, AS: метод Аюб-шкала, DH: метод Дейна-Германа, AB-PAS: периодическая кислота Альциана синего Шиффа, PAP : Быстрое окрашивание по Папаниколау и Граму).

Среди специальных красителей была обнаружена более высокая специфичность окрашивания методом D-H, за которым следуют A-S, AB-PAS, PAP и Грама (). Что касается интенсивности окрашивания, было обнаружено, что метод A-S был выше, за ним следуют AB -PAS, метод D-H, PAP и метод Грама (). В целом, специфичность и интенсивность окрашивания H и E оказались самыми высокими по сравнению со всеми специальными красителями.

Таблица 2

Статистические значения специфичности окрашивания.

Таблица 3

Статистические значения интенсивности окрашивания.

Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным красителям ().

Таблица 4

Статистическое значение для идентификации типа кератина.

Значение Каппа 0,57–0,60 предполагает удовлетворительное или умеренное согласие между наблюдателями.

Обсуждение

Специальные красители — это нестандартные красители, которые могут дифференцировать определенные клетки, компоненты тканей и микроорганизмы при нанесении на гистопатологические или цитологические препараты.Для выделения и выделения небольших очагов аномального ороговения показаны специальные красители для кератина.

Кератин состоит из нерастворимых белков, которые, в свою очередь, состоят из аминокислот с высоким содержанием сульфгидрила и дисульфида, поэтому его можно продемонстрировать гистохимическими методами аминокислот, такими как метод AB. Кроме того, кератин можно продемонстрировать с помощью реактива Шиффа после окисления перманганатом. Окисление, вероятно, приводит к образованию сильного окислителя небольших количеств альдегидных групп из некоторых составляющих кератинового белка.В настоящем исследовании вместо периодной кислоты для окисления использовался подкисленный раствор перманганата, что улучшило качество окрашивания комбинированного метода AB и PAS.8 Комбинированный метод AB и PAS окрашивает ткани, содержащие как нейтральные, так и кислые муцины в различные оттенки пурпурного.5,10

Кератины также ярко окрашиваются от красного и оранжевого до пурпурного оттенков, соответственно, флоксином, компонентом метода DH, и оранжевым красителем G, компонентом как окрашивания AS, так и PAP5,11 Кератин, а также как гранулы кератохилина, также являются умеренно грамположительными.5

В настоящем исследовании срезы орто- и паракератинизированной нормальной десны были одинаково различимы всеми специальными пятнами по сравнению с H и E. Что касается отдельных случаев, содержание кератина в просвете, а также тип ороговевшего эпителия ортокератинизированной одонтогенной кисты лучше наблюдались при использовании метода DH и AS (как специфичность, так и интенсивность были выше), чем при использовании H и E. керато-кистозные одонтогенные опухоли.

Закупорка паракератина в бородавчатой ​​карциноме и поверхностный кератин плоской папилломы и бородавчатой ​​гиперплазии лучше окрашивались по интенсивности с помощью DH, AS и AB -PAS, в свою очередь, с последующим окрашиванием по PAP и Граму, но в отношении специфичности Было обнаружено, что окраска H и E является более подходящей.

Однако не все кератиновые жемчужины, присутствующие в хорошо дифференцированных срезах ткани плоскоклеточной карциномы, могут быть положительно окрашены специальными красителями по сравнению с H и E, возможное объяснение состоит в том, что кератиновые жемчужины, положительно окрашенные специальными красителями, подверглись бы нормальному окрашиванию. Процесс созревания аналогичен физиологическому кератину, тогда как неокрашенные кератиновые жемчужины могут иметь определенные неизвестные биохимические различия в процессе созревания, что делает их менее реактивными к особым пятнам.6

Заключение

В настоящем исследовании среди всех специальных красителей D-H, A-S и AB-PAS продемонстрировали общее качество окрашивания, сопоставимое с H и E, что позволяет предположить их потенциальное использование в качестве альтернативных красителей для кератина. Кроме того, все специальные красители смогли успешно идентифицировать тип кератинизации и отчетливо окрашивать кератин, отличая его от других компонентов соединительной ткани с более высокой интенсивностью, однако H и E показали более высокую специфичность в целом.

Сноски

Конфликт интересов: нет

Источник поддержки: нет

Ссылки

2. Bragulla HH, Homberger DG. Структура и функции белков кератина в простом, многослойном, ороговевшем и ороговевшем эпителии. J Anat. 2009. 214 (4): 516–59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Гистология полости рта Нанси А. Тен Кейт: развитие, структура и функция. 8-е изд. Миссури, США: Мосби Эльзевьер; 2012 г.[Google Scholar] 5. Бэнкрофт Дж. Д., Гэмбл М. Теория и практика гистологических методов. 6-е изд. Филадельфия: Черчилль Ливингстон Эльзевьер; 2008. [Google Scholar] 6. Рамулу С., Кале А.Д., Халликеримат С., Котрашетти В. Сравнение модифицированного окрашивания папаниколау с окрашиванием айуб-шкларом и гематоксилин-эозином для демонстрации кератина в срезах ткани, залитых парафином. J Oral Maxillofac Pathol. 2013. 17 (1): 23–30. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Датчанин Е.Т., Герман Д.Л. Дифференциальное окрашивание прекератина, кератина и муцина гематоксилином-флоксином-альцианом сине-оранжевым G.Stain Technol. 1963; 38: 97–101. [PubMed] [Google Scholar] 8. Скотт HR, Clayton BP. Сравнение сродства к окрашиванию альдегид-фуксина и реактива Шиффа. J Histochem Cytochem. 1953; 1 (5): 336–52. [PubMed] [Google Scholar] 9. AI-Maaini R, Bryant P. Honey как альтернатива формалину в демонстрации компонентов соединительной ткани. J Histotechnol. 2008. 31 (2): 67–72. [Google Scholar] 10. Prunieras M. PAB: Ценный краситель для соединительной ткани, кератина и грибков. J Invest Dermatol. 1960; 35: 309–14.[PubMed] [Google Scholar] 11. Карсон Флорида, Криста Х. Гистотехнология: текст для самообучения. 3-е изд. Гонконг: Американское общество клинической патологии; 2009. [Google Scholar]

Сравнение специальных красителей для кератина с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином

J Int Oral Health. 2015 Март; 7 (3): 1–5.

Рупа С Рао

¹ Профессор и заведующий кафедрой патологии полости рта и микробиологии факультета стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Шанкаргуда Патил

² Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

Барнали Маджумдар

³ Аспирант, Отделение оральной патологии и микробиологии, Факультет стоматологических наук, М.С. Рамайя Университет прикладных наук, Бангалор, Карнатака, Индия

Ракеш Г. Освал

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница Массачусетса Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

¹ Профессор и руководитель Кафедра патологии полости рта и микробиологии, Факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая S наук, Бангалор, Карнатака, Индия

² Доцент, кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук им. М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

³ Аспирант, кафедра орального Патология и микробиология, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М.С. Рамая, Бангалор, Карнатака, Индия

⁴ Читатель, Отделение челюстно-лицевой хирургии, Стоматологический колледж и больница MA Рангунвала, Пуна, Махараштра, Индия

Адрес для корреспонденции: Dr.Патил С. Кафедра патологии полости рта и микробиологии, факультет стоматологических наук, Университет прикладных наук М. С. Рамая, Почта технологического института М. С. Рамая, М. С. Рамаяй Нагар, Бангалор — 560 054, Карнатака, Индия. Электронная почта: moc.liamg@2161litapbs

Поступила 12 мая 2014 г .; Принято 13 августа 2014 г.

Авторские права: © Journal of International Oral Health

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 3.0 Unported, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любых средний при условии правильного цитирования оригинала.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.

Abstract

Предпосылки:

Кератины являются наиболее распространенными белками и являются характерным признаком многих эпителиальных патологий, что делает их диагностически важным маркером, как гистопатологически, так и иммуногистохимически. Поскольку иммуногистохимия — это дорогостоящий диагностический инструмент, специальные пятна для определения степени ороговения могут служить более быстрым и экономичным вариантом. Целью настоящего исследования было сравнить эффективность специальных красителей для кератина со стандартными красителями гематоксилином и эозином (H и E).Цели включают: (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным окрашивателям: метод Аюб-шкала, метод Дейна-Германа, Альциановый синий –периодная кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму. . (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием гематоксилином и эозином (H и E). (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы:

Всего из архива отделения было извлечено 80 случаев известной патологии кератина, в том числе по 10 случаев нормальной десны, гиперкератоза, плоской папилломы, бородавчатой ​​гиперплазии, бородавчатой ​​карциномы, хорошо дифференцированной плоскоклеточной карциномы. , ортокератинизированные одонтогенные кисты и керато-кистозные одонтогенные опухоли. Были сделаны шесть срезов по 4 мкм каждый из парафиновых блоков, окрашенных H и E и специальными красителями, и они были оценены двумя патологами на основе модифицированных критериев оценки от Rahma Al-Maaini и Philip Bryant 2008.

Результаты:

Результаты были сведены в таблицу с использованием статистики хи-квадрат и каппа. Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным пятнам. Кроме того, все специальные окрашивания показали положительный результат и статистическую значимость (P <0,001) в отношении окрашивания кератина.

Заключение:

В заключение, хотя специальные пятна отчетливо окрашивали кератин с более высокой интенсивностью, H и E оказались в целом лучше по специфичности

Ключевые слова: Кератины, Ayoub-Shklar, Dane-Herman , alcian blue-period acid schiff, PAP, грамм

Введение

Кератины являются одним из основных и ключевых структурных белков, обнаруживаемых в самых высоких концентрациях и разнообразии в кератиноцитах кожного и орального эпителия, и на их долю приходится почти 80% от общего содержания белка в дифференцированных клетках многослойного эпителия.В 1900-х годах кератины считались белками, которые можно было извлекать из различных эпидермальных модификаций животных, таких как шерсть, рога, когти и т. Д. 1,2. Впоследствии, с развитием исследований и появлением 21 ^-го -го века. В настоящее время кератины (цитокератины) считаются белками промежуточных филаментов с определенными физико-химическими свойствами, обнаруженными в эпителии любого позвоночного. типы эпителия, а также разные слои единого многослойного эпителия.Основная функция цитокератинов, наряду с микротрубочками и микрофиламентами, заключается в обеспечении структурной целостности и механической устойчивости всех эукариотических клеток. наличие или отсутствие ороговения. Кератинизация или ороговение включает процесс цитодифференцировки кератиноцитов, начиная с их постформационного состояния, т.е.e., stratum basale до конечного дифференцированного состояния упрочненных ороговевших клеток, заполненных кератиновыми филаментами, обнаруженными в поверхностном слое, то есть в роговом слое.4

Широкий спектр наследственных, предраковых и злокачественных заболеваний возникает из-за дефектов в процессе кератинизации превращение кератиновых белков в важный диагностический инструмент. 4 Следовательно, одна из важных областей применения кератинов — это диагностика эпителиальных патологий. Хотя иммуногистохимия известна своей специфичностью в диагностике, она не является предпочтительным выбором из-за ее стоимости и затрат времени.Гематоксилин и эозин (H и E), обычные красители, не различают четко различные эозинофильные компоненты соединительной ткани, с другой стороны, специальные красители могут оказаться простым и экономичным решением для гистологического определения наличия и структуры кератина. .

В настоящем исследовании метод окрашивания по методу Аюб-Шклар (AS), метод Дейна-Германа (DH), Альциановый синий (AB) –периодическая кислота Шиффа (PAS), быстрое окрашивание по Папаниколау (PAP) и окрашивание по Граму сравнивались с обычным H и окрашивание E в отношении качества окрашивания и способности идентифицировать кератин.5

Цель и задачи

Целью настоящего исследования было сравнение эффективности специальных красителей для кератина со стандартными красителями H и E.

Цели исследования включают:

• (i) Подвергнуть диагностированные случаи кератиновых нарушений выбранным специальным пятнам: метод A-S, метод D-H, AB-PAS, быстрое PAP и окрашивание по Граму.
• (ii) Сравнить специфичность окрашивания и интенсивность окрашивания специальных красителей по сравнению с обычным окрашиванием H и E.
• (iii) Сравнить эффективность специальных красителей с обычными окрашиваниями H и E для определения типа кератина, присутствующего в выбранных случаях.

Материалы и методы

Выбор случая и процедура настоящего исследования изображены на и соответственно.

Выбор случая и порядок действий.

Таблица 1

Критерии, выбранные для оценки пятен9

Процедура окрашивания для окрашивания A-S была взята из Ramulu et al., краситель Дейн-Герман от Дейна и Германа и другие красители от Bancroft and Gamble. 5-7 Процедура AB -PAS была модифицирована от Скотта и Клейтона следующим образом: 8

1. Депарафинизируйте и гидратируйте срезы ткани дистиллированной воды.

2. Пятно в AB в течение 30 мин. Стирать в воде 5 мин.

3. Окисляют в подкисленном перманганате (равные части 0,5% перманганата калия и 0,5% серной кислоты) в течение 5 минут, промывают 2% щавелевой кислотой в течение 30 секунд и промывают водой в течение 5 минут.

4. Окрашивают в реактиве Шиффа в течение 15 минут и промывают водой в течение 10 минут.

5. Окрашивают гематоксилином Майера в течение 3 минут и промывают водой в течение 5 минут.

6. Обезвожить, очистить ксилолом и закрепить.

Статистический анализ

Результаты были сведены в таблицу с использованием критерия хи-квадрат и статистики каппа для вариаций между наблюдателями.

Результаты

Микрофотография кератина, окрашенного H и E, и специальных пятен представлена ​​на.В настоящем исследовании все специальные окрашивания показали положительные и статистически значимые ( P <0,001) результаты в отношении окрашивания кератина.

Микрофотография кератина, окрашенного H и E и различными специальными красителями (увеличение: 10 ×) (NG: нормальная десна, H: гиперкератоз, SP: плоская папиллома, VH: веррукозная гиперплазия, VCA: веррукозная карцинома, CA: хорошо дифференцированная плоскоклеточный рак, OOC: ортокератинизированные одонтогенные кисты, KCOT: керато-кистозная одонтогенная опухоль, H и E: гематоксилин и эозин, AS: метод Аюб-шкала, DH: метод Дейна-Германа, AB-PAS: периодическая кислота Альциана синего Шиффа, PAP : Быстрое окрашивание по Папаниколау и Граму).

Среди специальных красителей была обнаружена более высокая специфичность окрашивания методом D-H, за которым следуют A-S, AB-PAS, PAP и Грама (). Что касается интенсивности окрашивания, было обнаружено, что метод A-S был выше, за ним следуют AB -PAS, метод D-H, PAP и метод Грама (). В целом, специфичность и интенсивность окрашивания H и E оказались самыми высокими по сравнению со всеми специальными красителями.

Таблица 2

Статистические значения специфичности окрашивания.

Таблица 3

Статистические значения интенсивности окрашивания.

Статистические значения для идентификации типа кератинизации были незначительными, показывая, что орто- и паракератинизированный эпителий можно правильно идентифицировать как по H, так и по E, а также по всем специальным красителям ().

Таблица 4

Статистическое значение для идентификации типа кератина.

Значение Каппа 0,57–0,60 предполагает удовлетворительное или умеренное согласие между наблюдателями.

Обсуждение

Специальные красители — это нестандартные красители, которые могут дифференцировать определенные клетки, компоненты тканей и микроорганизмы при нанесении на гистопатологические или цитологические препараты.Для выделения и выделения небольших очагов аномального ороговения показаны специальные красители для кератина.

Кератин состоит из нерастворимых белков, которые, в свою очередь, состоят из аминокислот с высоким содержанием сульфгидрила и дисульфида, поэтому его можно продемонстрировать гистохимическими методами аминокислот, такими как метод AB. Кроме того, кератин можно продемонстрировать с помощью реактива Шиффа после окисления перманганатом. Окисление, вероятно, приводит к образованию сильного окислителя небольших количеств альдегидных групп из некоторых составляющих кератинового белка.В настоящем исследовании вместо периодной кислоты для окисления использовался подкисленный раствор перманганата, что улучшило качество окрашивания комбинированного метода AB и PAS.8 Комбинированный метод AB и PAS окрашивает ткани, содержащие как нейтральные, так и кислые муцины в различные оттенки пурпурного.5,10

Кератины также ярко окрашиваются от красного и оранжевого до пурпурного оттенков, соответственно, флоксином, компонентом метода DH, и оранжевым красителем G, компонентом как окрашивания AS, так и PAP5,11 Кератин, а также как гранулы кератохилина, также являются умеренно грамположительными.5

В настоящем исследовании срезы орто- и паракератинизированной нормальной десны были одинаково различимы всеми специальными пятнами по сравнению с H и E. Что касается отдельных случаев, содержание кератина в просвете, а также тип ороговевшего эпителия ортокератинизированной одонтогенной кисты лучше наблюдались при использовании метода DH и AS (как специфичность, так и интенсивность были выше), чем при использовании H и E. керато-кистозные одонтогенные опухоли.

Закупорка паракератина в бородавчатой ​​карциноме и поверхностный кератин плоской папилломы и бородавчатой ​​гиперплазии лучше окрашивались по интенсивности с помощью DH, AS и AB -PAS, в свою очередь, с последующим окрашиванием по PAP и Граму, но в отношении специфичности Было обнаружено, что окраска H и E является более подходящей.

Однако не все кератиновые жемчужины, присутствующие в хорошо дифференцированных срезах ткани плоскоклеточной карциномы, могут быть положительно окрашены специальными красителями по сравнению с H и E, возможное объяснение состоит в том, что кератиновые жемчужины, положительно окрашенные специальными красителями, подверглись бы нормальному окрашиванию. Процесс созревания аналогичен физиологическому кератину, тогда как неокрашенные кератиновые жемчужины могут иметь определенные неизвестные биохимические различия в процессе созревания, что делает их менее реактивными к особым пятнам.6

Заключение

В настоящем исследовании среди всех специальных красителей D-H, A-S и AB-PAS продемонстрировали общее качество окрашивания, сопоставимое с H и E, что позволяет предположить их потенциальное использование в качестве альтернативных красителей для кератина. Кроме того, все специальные красители смогли успешно идентифицировать тип кератинизации и отчетливо окрашивать кератин, отличая его от других компонентов соединительной ткани с более высокой интенсивностью, однако H и E показали более высокую специфичность в целом.

Сноски

Конфликт интересов: нет

Источник поддержки: нет

Ссылки

2. Bragulla HH, Homberger DG. Структура и функции белков кератина в простом, многослойном, ороговевшем и ороговевшем эпителии. J Anat. 2009. 214 (4): 516–59. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 3. Гистология полости рта Нанси А. Тен Кейт: развитие, структура и функция. 8-е изд. Миссури, США: Мосби Эльзевьер; 2012 г.[Google Scholar] 5. Бэнкрофт Дж. Д., Гэмбл М. Теория и практика гистологических методов. 6-е изд. Филадельфия: Черчилль Ливингстон Эльзевьер; 2008. [Google Scholar] 6. Рамулу С., Кале А.Д., Халликеримат С., Котрашетти В. Сравнение модифицированного окрашивания папаниколау с окрашиванием айуб-шкларом и гематоксилин-эозином для демонстрации кератина в срезах ткани, залитых парафином. J Oral Maxillofac Pathol. 2013. 17 (1): 23–30. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7. Датчанин Е.Т., Герман Д.Л. Дифференциальное окрашивание прекератина, кератина и муцина гематоксилином-флоксином-альцианом сине-оранжевым G.Stain Technol. 1963; 38: 97–101. [PubMed] [Google Scholar] 8. Скотт HR, Clayton BP. Сравнение сродства к окрашиванию альдегид-фуксина и реактива Шиффа. J Histochem Cytochem. 1953; 1 (5): 336–52. [PubMed] [Google Scholar] 9. AI-Maaini R, Bryant P. Honey как альтернатива формалину в демонстрации компонентов соединительной ткани. J Histotechnol. 2008. 31 (2): 67–72. [Google Scholar] 10. Prunieras M. PAB: Ценный краситель для соединительной ткани, кератина и грибков. J Invest Dermatol. 1960; 35: 309–14.[PubMed] [Google Scholar] 11. Карсон Флорида, Криста Х. Гистотехнология: текст для самообучения. 3-е изд. Гонконг: Американское общество клинической патологии; 2009. [Google Scholar]

Папаниколау (мазок Папаниколау) Протокол

Протокол Папаниколау (мазок Папаниколау)

Реагенты для окрашивания Папаниколау

Описание: Пятно Папаниколау (также пятно и Пап пятно) — это многоцветное окрашивание гистологический метод, разработанный Джорджем Папаниколау, отец цитопатологии.Окрашивание Папаниколау используется для дифференциации клеток в мазке. препараты различных телесных выделения; образцы могут быть гинекологическими мазками (Пап мазки), мокрота, чистки зубов, промывания, моча, спинномозговая жидкость, брюшная жидкость, плевральная жидкость, синовиальная жидкость, семенная жидкость, тонкая игла материал, образцы прикосновения опухоли или другие материалы, содержащие клетки. Окрашивание Пап — очень надежный метод. Таким образом, он используется для шейного отдела скрининг рака в гинекологии.Вся процедура известна как мазок Папаниколау.

Классическая форма мазка Папаниколау включает пять красителей в три решения:

• Ядерное пятно, гематоксилин, используется для окрашивания ядер клеток.
• Первый контраст ОГ-6. В Оранжевый G используется для окрашивания кератина. Его первоначальная роль заключалась в окрашивании мелких клеток ороговевшего плоскоклеточного покрова. клеточная карцинома присутствует в мокроте.

Второй советник (Eosin Azure) контрастное пятно, состоящее из трех красителей; номер обозначает долю красителей, например.ЭА-50, ЭА-65.

• Пятна Eosin Y поверхностный плоский эпителиальный клетки, ядрышки, реснички и красные кровяные клетки.
• светло-зеленый SF желтоватый окрашивает цитоплазму все остальные клетки. Этот краситель сейчас довольно дорогой и трудно достать, поэтому некоторые производители переключение на Fast Green FCF, однако он дает визуально другие результаты и некоторыми не считается удовлетворительным.
• Бисмарк коричневые морилки Y ничего и в современных формулировках часто опущено.

При правильном выполнении окрашенный образец должен иметь оттенки. из всего спектра: красный, оранжевый, желтый, зеленый, синий и фиолетовый. Хроматин узоры хорошо видны, клетки пограничных очагов легче интерпретировать, микрофотографии лучше, а окрашенные клетки красивы. В результате окрашивания получается очень прозрачный ячеек, поэтому даже более толстые образцы с перекрывающимися ячейками могут быть интерпретируется.

На хорошо подготовленном образце ядра клеток имеют ярко-синий цвет. чернить. Клетки с высоким содержанием кератина желтые, гликогеновые. пятна тоже желтые. Поверхностные клетки от оранжевого до розового, а промежуточные и парабазальные клетки имеют цвет от бирюзового до синего. Метапластические клетки часто окрашиваются одновременно и в зеленый, и в розовый цвет.

Фиксация: Зафиксировать мазок по стандарту процедура. Например, 95% спирт или 100% метанол.

Процедура 1 (стандартная Метод):

1. 95% Этанол 15 минут (фиксация)

2. Полоскание в водопроводной воде

3. Гематоксилин Харриса или Гилла 1-3 минуты (время зависит от выбора. раствора гематоксилина)

4. Полоскание в водопроводной воде или водопроводной воде Скотта

5. 95% Этанол 10 капель

6. Окраска ОГ-6 за 1.5 минут.

7. 95% Этанол 10 капель

8. EA-50, или модифицированное окрашивание EA-50, или EA-65 в течение 2,5 минут.

9. 95% Этанол 10 капель, 2 смены

10. 100% этанол 1 минута

11. Очистите за 2 смены ксилола, по 2 минуты каждая

12. Крепление с постоянной монтажной средой

Процедура 2 (Модифицированный Пап Процедура):

1. 95% Этанол 15 минут (фиксация)

2. Дистиллированная вода 10 капель, 2 смены

3. Жаберный гематоксилин 2 минуты

4. Дистиллированная вода 10 капель

5. Водопроводная вода Скотта 1 минута

6. Дистиллированная вода 10 капель, 2 смены

7. 95% Этанол 10 капель, 2 смены

8. Окраска ОГ-6 1-2 минуты

9. 95% Этанол 10 капель, 3 смены

10. Окрашивание EA-50 или EA-65 в течение 6-10 минут

11. 95% Этанол 20-30 капель, 3 смены

12. Абсолютный этанол 10 капель

13. Прозрачный в ксилоле

14. Крепление с постоянной монтажной средой

Процедура 3 (Быстрая Экономичный, уксусная кислота, метод окрашивания по Папаниколау):

1. 1% уксусная кислота 10 капель

2. Harris’s Haematoxylin, предварительно нагретый до 60 ° C, 10 соусов

3. Водопроводная вода 10 дипсов

4. 1% уксусная кислота 10 капель

5. OG-6 10 дипсов

6. 1% уксусная кислота 10 капель

7. EA-50 10 отжимов

8. 1% уксусная кислота 10 капель

9. Метанол 10 капель

10. Ксилол 10 капель

Блоттинг проводился после каждого шага.Крепление D.P.X

Артикул:

Rapid Economic, Уксусная кислота, Метод окрашивания Папаниколау

Пап-окрашивание от Histonet

Лаборатория 4: Кислотно-стойкие, споры и пятна на капсулах

КИСЛОТА-БЫСТРЫЙ

Кислотостойкое окрашивание — это дифференциальное окрашивание, используемое для идентификации кислотоустойчивых организмов, таких как представители рода Mycobacterium.Кислотоустойчивые организмы характеризуются воскоподобными, почти непроницаемыми клеточными стенками; они содержат миколиновую кислоту и большое количество жирных кислот, восков и сложных липидов. Этот тип клеточной стенки устойчив к большинству соединений, поэтому кислотоустойчивые организмы требуют специальной техники окрашивания.

Основной краситель, используемый для кислотостойкого окрашивания, карбол фуксин, является жирорастворимым и содержит фенол, который помогает красителю проникать через клеточную стенку. Этому также способствует добавление тепла в виде тепла (пара).Пар помогает ослабить восковой слой и способствует проникновению первичного пятна внутрь клетки. Затем мазок промывают очень сильным обесцвечивающим средством, которое удаляет пятно со всех некислотных клеток, но не проникает через клеточную стенку кислотоустойчивых организмов. Затем обесцвеченные некислотные клетки поглощают контрастное пятно, которым в нашем случае является метиленовый синий.

1. Работая в парах, подготовьте ТРИ предметных стекла, как указано ниже (2 для дублирования и один для окрашивания).

2.Обозначьте каждый слайд и нарисуйте круг в центре слайда восковым карандашом.

3. Приготовьте эмульсию на каждом слайде с 4 полными петлями Staphylococcus epidermidis из бульонной культуры на слайде (это будут ваши кислотоустойчивые отрицательные бактерии).

4. Затем добавьте одну петлю Mycobacterium chelonae (это ваши кислотоустойчивые положительные бактерии) и смешайте две бактерии вместе.

5. Дайте слайдам высохнуть на воздухе на подогревателях (пока эти слайды сохнут, подготовьте слайды для пятен споры).

6. Как только жидкость полностью испарится, зафиксируйте бактерии нагреванием, трижды пропустив ее через пламя.

7. Убедитесь, что ползунок наверху стакана полностью выровнен. Затем доведите воду до кипения, пока слайды сохнут.

Вам нужно всего около 200 миллилитров воды. Если вы добавите еще, вы будете ждать весь лабораторный период, пока вода закипит.

8. Когда вода закипит, поместите слайд на решетку над кипящей водой.

9. Накройте область мазка на слайде квадратным листом бумажной салфетки PRECUT. Убедитесь, что бумага не свисает со слайда.

10. Осторожно нанесите пятно CARBOL FUCHSIN на бумажное полотенце.

Если в кипящей воде появилось пятно, пожалуйста, остановитесь и слейте загрязненную воду в контейнер для жидких отходов. Пары карбол-фуксина могут быть токсичными.

11. Пропаривайте пятно на предметном стекле в течение 7 минут, непрерывно нанося больше пятен, чтобы бумажный квадрат никогда не высыхал.

12. Осторожно удалите бумагу щипцами и выбросьте ее в небольшой стаканчик для макулатуры, который будет предоставлен на вашем столе. Затем промойте предметное стекло водой.

13. Поместите предметное стекло в таз для окрашивания и осторожно промойте водой.

14. Обесцвечивайте с помощью 6 капель кислого спирта (не этанола из вашего набора для окрашивания граммов), затем смойте водой.

15. Контрастите метиленовым синим в течение 2 минут.

16. Промойте водой и промокните пропиточной бумагой (не используйте подогреватель предметных стекол).

17. Осмотрите объект под линзой объектива 100X с масляной иммерсией и запишите свои результаты.

Цвета этого изображения могут немного отличаться из-за печати / копирования.

СПОРНАЯ ПЯТНА

Окрашивание эндоспор — это дифференциальное окрашивание, используемое для визуализации бактериальных эндоспор. Эндоспора — это спящая форма бактерии, которую некоторые виды бактерий продуцируют в стрессовых условиях, таких как плохое питание, высокие температуры или сухая среда.Внешний слой состоит из кератина, устойчивого к окрашиванию. Пятно малахитового зеленого цвета вдавливается в споры с помощью пара. Споры могут быть центральными, терминальными и субтерминальными. Эта окраска обычно используется для обнаружения спор, произведенных из родов Bacillus и Clostridium.

18. Приготовьте два предметных стекла с эмульсиями, одно из планшета A и одно из планшета B.

19. Нагрейте слайды и поместите их на решетку над кипящей водой.

20.Накройте область мазка на каждом слайде квадратным кусочком бумажного полотенца PRECUT.

21. Осторожно нанесите морилку МАЛАХИТОВОЕ ЗЕЛЕНОЕ на бумажное полотенце.

22. Готовьте на пару в течение 10 минут и все это время держите бумагу пропитанной пятном.

23. Осторожно удалите бумагу с помощью щипцов, выбросьте ее в небольшой стаканчик для макулатуры, который будет предоставлен на вашей скамейке, а затем промойте предметное стекло водой.

24. Поместите слайды в таз для окрашивания и осторожно промойте водой.

25. Контрастируйте с помощью SAFRANIN в течение 1 минуты, а затем промойте водой. Промокните насухо пропиточной бумагой.

26. Осмотрите объект под линзой объектива 100X с масляной иммерсией и запишите свои результаты.

Цвета этого изображения могут немного отличаться из-за печати / копирования.

КАПСУЛЬНАЯ ПЯТЬ

Большинство капсул состоит из полисахаридов или полипептидов, которые представляют собой толстый, детектируемый и дискретный слой за пределами клеточной стенки.Некоторые капсулы имеют четко очерченные границы, а некоторые — нечеткие задние края. Капсулы защищают бактерии от фагоцитарного действия иммунных клеток и позволяют патогенам проникать в организм. Если возбудитель теряет способность образовывать капсулы, он часто перестает быть патогенным.

27. Пометьте и приготовьте предметное стекло с эмульсией Klebsiella pneumoniae.

28. Дайте ему высохнуть на воздухе (НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ НАГРЕВАТЕЛЬ, НЕ НАГРЕВАЙТЕ FIX).

29. Окрашивайте 1% кристаллическим фиолетовым в течение 2 минут (НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ФИОЛЕТ ОТ ГРАММОВЫХ ПЯТЕН).

30. ОЧЕНЬ Бережно смыть 6 каплями медного купороса.

31. Дайте ему высохнуть на прилавке (не используйте подогреватель).

32. Осмотрите объект под линзой объектива 100X с масляной иммерсией и запишите свои результаты.

границ | Ретракция кератина и интернализация десмоглеина-3 независимо способствуют диссоциации клеток, индуцированной аутоантителами, при Pemphigus Vulgaris

Введение

Pemphigus vulgaris (PV) — тяжелое аутоиммунное заболевание, поражающее кожу и слизистые оболочки (1).Заболевание вызывается аутоантителами, развивающимися против трансмембранных молекул клеточной адгезии кадгеринового типа десмоглеина (Dsg) 3 и Dsg1, что приводит к потере межклеточной адгезии. Это приводит к образованию волдырей преимущественно на слизистой оболочке ротовой полости и эпидермисе. Вместе с десмоколлинами Dsgs формируют ядро ​​десмосом, структур межклеточной адгезии, изобилующих в тканях, подвергающихся высоким степеням механического стресса (2). В десмосомах молекулы трансмембранной адгезии образуют кластеры в мембране и внеклеточно связываются со своими аналогами в мембране противостоящих клеток.Внутриклеточно они связаны с сетью промежуточных филаментов через линкерные молекулы плакоглобин (Pg), плакофилины (Pkp) и десмоплакин (Dp). Это устройство представляет собой механически стабильную, но настраиваемую сетку, стабилизирующую целые ткани (3). Механизмы, приводящие к потере сцепления клеток при ПВ, сложны, поскольку аутоантитела препятствуют обмену десмосомных молекул и белков, ассоциированных с десмосомами (4, 5). Интернализация и истощение Dsg3 вместе с другими десмосомными компонентами, а также изменения сети кератиновых промежуточных филаментов (KIF) являются двумя отличительными признаками заболевания, обнаруживаемыми при биопсии кожи пациента и воспроизводимыми в моделях болезни (6).

Считается, что истощение мембраны

Dsg3 происходит на двух уровнях (4, 5): (i) молекулы, уже доставленные к мембране, но еще не включенные в десмосомы, подвергаются эндоцитозу, что приводит к вмешательству в сборку десмосом, и (ii) существующие десмосомы разбираются и десмосомы подвергаются эндоцитозу. молекулы или даже «полудесмосомы» интернализуются. Измененный оборот десмосомных молекул связан с множеством сигнальных событий в ответ на связывание аутоантител и зависит от достаточного количества липидных рафтов.Молекулы десмосом расположены в этих обогащенных липидами мембранных доменах, и сборка и разборка десмосом нарушаются при применении агентов, истощающих холестерин (7, 8). Кроме того, было показано, что p38MAPK, центральная молекула, не регулируемая при пузырчатке, важна для интернализации Dsg3 (9), а также для изменений сети KIF в ответ на лечение PV-IgG (10, 11).

Кератиновые промежуточные филаменты не являются статическими структурами, но постоянно модифицируются, чтобы адаптироваться к сигналам окружающей среды (3, 12).KIF зарождаются на периферии клетки, удлиняются и транспортируются к ядру, а также разбираются в перинуклеарной области, чтобы обеспечить повторную сборку в коре клетки (13). Что касается скорости оборота, было высказано предположение, что динамический, быстро меняющийся пул можно отличить от стабильного пула KIF, вставленных в десмосомальную или гемидесмосомную бляшку (14). Динамика сети KIF сильно регулируется посттранскрипционными модификациями, особенно фосфорилированием (12, 15). Напротив, , KIF регулируют активность киназ, по крайней мере частично, посредством функций каркаса.Например, KIFs секвестрируют PKCα через адаптерный белок RACK1 и стабилизируют десмосомы, подавляя активность PKC (16), которая также нарушается в ответ на аутоантитела к пузырчатке (17). Недавно было продемонстрировано, что казеинкиназа 1α (CK-1α) локализуется в KIF через FAMH83, что важно для связывания KIF и оборота десмосом (18, 19).

Изменения сети KIF при пузырчатке, описанные как «ретракция кератина», изучены не полностью. Ранние ультраструктурные исследования при биопсиях пациентов показали снижение количества KIF на периферии клеток (20).KIF конденсируются в более толстые пучки, сгруппированные в перинуклеарной области, и теряют контакт с десмосомной бляшкой. Однако неясно, связаны ли этот феномен и интернализация десмосомных молекул в ответ на аутоантитела. Более того, неизвестно, являются ли изменения KIF причиной или, скорее, следствием истощения Dsg3 и потери клеточной когезии в PV.

Чтобы ответить на эти вопросы, мы применили подходы к визуализации в реальном времени и биохимические анализы, чтобы определить временную взаимосвязь между интернализацией Dsg3 и ретракцией кератина и определить, как эти изменения цитоскелета вносят вклад в потерю клеточной адгезии в PV.

Материалы и методы

Культура клеток, тестовые реагенты и конструкции

Иммортализованная линия клеток кератиноцитов человека HaCaT и клетки HaCaT, стабильно экспрессирующие человеческий цитокератин 5 (CK5), слитый с желтым флуоресцентным белком (YFP, любезный подарок Рейнхарда Виндоффера и Николь Шварц, Институт молекулярной и клеточной анатомии, RWTH Aachen University), культивировали в Дульбекском университете. Модифицированная среда Игла с добавлением 10% FCS (Biochrom, Берлин, Германия), 50 Ед / мл пенициллина и 50 Ед / мл стрептомицина (оба AppliChem, Дармштадт, Германия) и 0.5 мг / мл G418 в случае HaCaT-CK5-YFP для отбора. Клетки выращивали в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ при 37 ° C. Клетки использовали через 24 ч после достижения слияния. Среду меняли за день до проведения экспериментов. Инкубации проводились в течение указанного периода времени. Ингибитор казеинкиназы 1 (СК-1) D4476 (Abcam, Кембридж, Великобритания) использовали в концентрации 100 мкМ. Метил-β-циклодекстрин (Sigma Aldrich, Мюнхен, Германия), называемый β-MCD, применяли в концентрации 1 мМ.

pDEST-mDsg3-mCherry-N1 был сконструирован с использованием системы рекомбинационного клонирования Gateway (ThermoFisher, Waltham, MA, USA). Вкратце, полноразмерная нуклеотидная последовательность, кодирующая мышиный Dsg3, была амплифицирована с помощью ПЦР с использованием праймеров, несущих attB-специфические сайты. Были использованы следующие праймеры: mDsg3-FW, 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCatgacctgcctcttcc-3 ‘и mDsg3-Rev, 5’GGGGACCACTTTTGTACgggacGacGacTagCTGTGTACgggaGacGacTagCTGTGTACgggaGacGacTagCTGTGTACgggaGacGacTagCTGTGTACgggaGacGactagCTGTGTACGGACGAgTAGTAGTACGGACGACGACTAGTGGGGGGACCACTTTG комплементарен кДНК Dsg3 мыши.ПЦР-ампликон, фланкированный attB, вставляли в вектор pDONR, содержащий attP (ThermoFisher), и, таким образом, генерировали входной клон. Следуя инструкциям производителя, вставку субклонировали в вектор-адресат (pDEST-mCherry-N1, Plasmid # 31907, Addgene). В результате mDsg3 был слит с mCherry на его C-конце.

Очищение сывороток от пузырчатки и IgG

сыворотки от пемфигуса (PV-IgG) были предоставлены Энно Шмидтом (Институт экспериментальной дерматологии Любека, Университет Любека, Германия).Титры ELISA были следующими: PV1-IgG: анти-Dsg3: 181,44, анти-Dsg1 212,27; PV2-IgG: анти-Dsg3: 206,21 и анти-Dsg1: 182,15. Использование IgG пациентов было одобрено этическим комитетом (AZ12-178). Дополнительного одобрения исследования не требовалось в соответствии с местными и национальными рекомендациями. И PV-IgG, и фракции IgG, объединенные от трех разных здоровых доноров (Control-IgG), очищали, как описано ранее (21). Вкратце, фракции иммуноглобулинов экстрагировали из сыворотки путем иммобилизации на агарозе с протеином А (ThermoFisher) в колонках для очистки в течение 3 часов при комнатной температуре.После центрифугирования сыворотку удаляли и агарозу промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). После элюции антител цитратным буфером натрия (20 мМ, pH 2,4) и нейтрализации Na ₂ CO ₃ фильтровальная установка (Amicon Ultra – 4, 100k; Merck Millipore, Дармштадт, Германия) позволила сконцентрировать Фракция IgG на уровне 19000 г в течение 20 мин. IgG хранили в PBS и использовали в концентрации 250 мкг / мл. AK23, моноклональное антитело, полученное из модели мышей PV (Biozol, Eching, Германия), использовали в концентрации 75 мкг / мл.

Иммуноокрашивание

клеток HaCaT, стабильно экспрессирующих CK5-YFP, выращивали на покровных стеклах и фиксировали 2% формалином в PBS (свежеприготовленный из параформальдегида) в течение 10 минут при комнатной температуре перед обработкой 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут, чтобы гарантировать проницаемость. . Впоследствии клетки блокировали 1% нормальной козьей сывороткой и 3% BSA в PBS в течение 45 минут. Клетки инкубировали с антителом против Dsg3 (клон 5G11, sc-53487, Santa Cruz Biotechnology, Гейдельберг, Германия) при 4 ° C в течение ночи.Вторичное козье антимышиное антитело, конъюгированное с Cy3 (Dianova, Гамбург, Германия), применяли в течение 1 часа при комнатной температуре. 1,5% N -пропилгаллат использовали в качестве противозадирного соединения для заделки стеклянной чашки с культивированными клетками на предметных стеклах. Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Leica SP5 с объективом 63 × NA 1.4 PL APO. Конфокальная микроскопия выполнялась с использованием лазеров с длинами волн 514 и 543 нм для возбуждения. Анализ проводился с использованием ImageJ (www.nih.gov). Инструмент «Прямой столбик» использовался для построения профилей интенсивности исследуемых областей.Прямую полосу длиной 15 мкм и шириной 20 пикселей помещали перпендикулярно по границе двух соседних ячеек. Dsg3 использовался для обозначения границы ячейки. Положение полосы не изменялось для построения профиля интенсивности соответствующего изображения CK5. Полученные профили интенсивности, показывающие распределение интересующего белка, были составлены в Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) и впоследствии нормализованы к исходному уровню.

Вестерн-блоттинг и лизаты

Клетки промывали PBS и затем лизировали SDS-лизисным буфером (25 ммоль / л HEPES, 2 ммоль / л EDTA, 25 ммоль / л NaF и 1% SDS, pH 7.4) с последующей обработкой ультразвуком. Количество белка определяли методом BCA (ThermoFisher, США). Готовили смесь лизата и буфера Лэммли, содержащую 50 мМ дитиотреитола, и 10 мкг белка наносили на гель для электрофореза. Электрофорез и вестерн-блоттинг проводили по стандартным процедурам. Мембраны были заблокированы либо в 5% сухом обезжиренном молоке, растворенном в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,05% твин (TBS-T), либо в 5% BSA в TBS-T при комнатной температуре в течение 1 часа.Следующие антитела применяли в BSA в TBS-T при 4 ° C в течение ночи: Dsg3 pAb (ELA-EAP3816-120, Biozol), Desmoplakin I / II pAb (H-300) (sc-33555, Santa Cruz), CK14 mAB. (LL002) (ab7800, Abcam, Кембридж, Великобритания), GAPDH mAb (0411) (sc-47724, Santa Cruz), фосфо-p38 MAPK pAb (Thr180 / Tyr182, D3F9) (# 4511, Cell Signaling, Кембридж, Великобритания), и p38 MAPK pAb (№ 9212, Cell Signaling). Связанные с HRP антитела козы против мыши или антитела козы против кролика (оба Dianova) применяли в качестве вторичных антител при комнатной температуре.Мембраны были разработаны с использованием системы ECL (GE Healthcare, Мюнхен, Германия). Вестерн-блоты анализировали путем измерения интегральной плотности полос после вычитания фона с помощью ImageJ.

Фракционирование белков Triton X-100

клеток HaCaT-CK5 помещали на лед и промывали ледяным PBS. Буфер для экстракции (0,5% Triton X-100, 50 ммоль / л MES, 25 ммоль / л EGTA, 5 ммоль / л MgCl ₂ ), содержащий 0,1% лейпептин, апротинин и пепстатин, а также 1% фенилметилсульфонилфторид, применялся для 10 минут при легком встряхивании на льду с последующим соскобом для извлечения лизатов.Центрифугирование при 19000 g в течение 10 мин при 4 ° C позволило отделить нерастворимую в цитоскелете фракцию от не связанной с цитоскелетом фракции, растворимой в тритоне. Растворимую фракцию Triton X-100 собирали и обрабатывали отдельно для блоттинга. Полученный осадок, представляющий собой нерастворимую фракцию, суспендировали в буфере для лизиса SDS (25 ммоль / л HEPES, 2 ммоль / л EDTA, 25 ммоль / л NaF и 1% SDS, pH 7,4) и обрабатывали ультразвуком. Уровни белка в обеих фракциях измеряли с использованием метода BCA (ThermoFisher).5 или 10 мкг каждой фракции смешивали с буфером Лэммли и подвергали вестерн-блоттингу.

Анализ биотинилирования

После инкубации клетки HaCaT-CK5 помещали на лед и тщательно промывали HbSS. За этим этапом следовала инкубация в течение 1 часа с 0,25 мМ мембранопроницаемым сульфо-NHS-биотином EZ-Link (ThermoFisher). Чтобы удалить избыток биотина, клетки промывали ледяным HbSS, содержащим 100 мМ глицина, а затем простой HbSS. При осторожном встряхивании клетки инкубировали с охлажденным буфером для лизиса (50 мМ NaCl, 10 мМ PIPES, 3 мМ MgCl ₂ , 1% Triton X-100, 1% фенилметилсульфонилфторид, 0.1% каждого лейпетина, апротинина и пепстатина) в течение 20 минут на льду. Лизаты получали путем соскабливания и последующего центрифугирования при 19000 g в течение 5 минут. Получали супернатант и измеряли концентрацию белка с использованием метода BCA (ThermoFisher). 250 мкг белка смешивали с 70 мкл NeutrAvidin (HighCapacity) -агарозы (ThermoFisher) и помещали на ротатор на ночь при 4 ° C. На следующий день гранулы агарозы пять раз промывали холодным буфером для лизиса. Биотинилированный белок, присоединенный к агарозе, суспендировали в 3 × буфере Лэммли, содержащем 50 мМ дитиотреитола (AppliChem).Лизаты загружали в гели и проводили вестерн-блоттинг, как описано выше. Биотин во фракции, связанной с биотином, определяли с использованием стрептавидин-HRP (Cell Signaling), измеряли интегральную плотность всей дорожки для каждого состояния и использовали в качестве контроля загрузки. Репрезентативные участки мембран показаны на фигурах. Весь лизат нормализовали до GAPDH.

Анализ Phos-tag ™

Для определения состояния фосфорилирования белка проводили SDS-PAGE марганца (II) -Phos-tag ™ (Wako Chemicals GmbH, Штайнбах, Германия).Компонент Phos-tag, который включен в гель, снижает скорость миграции фосфорилированных белков в процессе электрофореза. Дисбаланс скорости миграции между фосфорилированными белками и их низшими или нефосфорилированными аналогами позволяет обнаруживать состояние фосфорилирования. После указанной обработки клеток реагентом D4476 клетки HaCaT-CK5 помещали на лед и промывали предварительно охлажденным TBS и лизировали в буфере Лэммли с добавлением 0,1% каждого лейпептина, пепстатина и апротинина, 1% фенилметилсульфонилфторида, ингибитора фосфатазы ( Roche) и 50 мМ дитиотреитола.SDS-PAGE марганца (II) -Phos-tag ™ выполняли в соответствии с инструкциями производителя. Для электрофореза были приготовлены свежеприготовленные 6% полиакриламидные гели, содержащие либо 0 мМ (контрольный гель), либо 30 мМ Phos-tag ™ ALL-107 (Wako Chemicals). Лизаты обрабатывали ультразвуком и наносили на гели. Mn ²⁺ удаляли из гелей путем двукратной промывки в течение 10 мин в буфере для переноса, содержащем 30 мМ EDTA. Затем последовала третья стадия промывки в буфере для переноса без EDTA в течение 10 мин. Белки переносили на PVDF-мембрану (Bio-Rad Laboratories, Мюнхен, Германия).Применяли антитела, как подробно описано в разделе Вестерн-блоттинг.

Анализ диссоциации на основе диспазы

кератиноцитов HaCaT высевали в двух экземплярах для каждого условия и выращивали в течение 24 часов после достижения слияния. Клетки промывали предварительно нагретым PBS и затем инкубировали с HbSS, содержащим Dispase II (> 2,4 Ед / мл; Sigma Aldrich) в течение 20 минут при 37 ° C, чтобы отделить монослой клеток от дна лунки. Раствор Dispase II был заменен на HbSS. К клеточным листам прикладывали определенное напряжение сдвига путем пипетирования монослоя 10 раз с помощью электрической пипетки на 1 мл.Повышенное количество фрагментов, подсчитываемое под бинокулярным микроскопом, по сравнению с контрольными условиями, указывает на потерю межклеточной адгезии. Для лучшего отображения фрагментов во флаконы на 20 мин добавляли 10 мкМ тиазолилового синего тетразолийбромида (МТТ) (SigmaAldrich) для окрашивания жизнеспособных клеток.

Визуализация живых клеток

клеток HaCaT-CK5 высевали в восьмилуночные камеры для получения изображений с μ-слайдом (Ibidi, Martinsried, Германия) и выращивали до слияния. Модифицированную Дульбекко среду Игла с добавками заменяли модифицированной Дульбекко средой Игла без фенолового красного.Трансфекцию pDest-mDsg3-mCherry для экспериментов по двойной трансфекции проводили через 3 дня после посева клеток при конфлюэнтности 90% с липофектамином LTX с реагентом Plus (ThermoFisher). Трансфекцию проводили в соответствии с протоколом производителя, инкубируя клетки с конечной концентрацией 3 мкг плазмидной ДНК, 3 мкл Plus-Reagent и 5 мкл LTX-Reagent на миллилитр в течение 4 часов. Эксперименты проводили через 24 ч после трансфекции. Эксперименты по визуализации живых клеток проводили с использованием конфокального микроскопа Leica SP5 с числовой апертурой 63 × NA 1.2 PL APO для воды или масляный объектив 63 × NA 1.4 PL APO. Корпус инкубатора (OKOLAB, Поццуоли, Италия) гарантировал постоянную влажную атмосферу при 37 ° C с 5% CO ₂ .

Нетрансфицированные клетки HaCaT CK5-YFP получали с помощью аргонового лазера мощностью 20 мВт при длине волны 514 нм и мощности лазера 3%. Был создан стек, покрывающий весь z-размер монослоя с шагом 0,5 мкм, и каждые 30 с регистрировались стеки 512 × 512 пикселей. Z-стеки клеток HaCaT CK5-YFP, трансфицированных Dsg3-mCherry, получали путем последовательной визуализации с использованием аргонового лазера 514 нм и лазерной линии 10 мВт 543 нм при мощности 20%.Изображения получали каждые 2 мин.

Анализ изображений живых клеток

Все стеки были деконволюционны с использованием программного обеспечения Huygens Essentials (Scientific Volume Imaging, Hilversum, Нидерланды) при соотношении сигнал / шум 10 и максимальном 30 итерациях. Дальнейший анализ необработанных данных изображения был выполнен с помощью ImageJ, если не указано иное.

Для анализа количества кератиновых мостиков соседних клеток использовали проекцию максимальной интенсивности всех слоев.KIF, «соединяющие» две соседние ячейки, подсчитывались вручную и соотносились с длиной соответствующей области границы ячейки. Для измерения интенсивности на периферии клетки применяли проекцию слоев, покрывающих нижние 4 мкм клетки. Размер ячеек KIF отличается от периферии клетки к ядру (22), феномен, который также был очевиден для HaCaT, экспрессирующих CK5-YFP. Следуя этому указанию, средняя интенсивность периферии клетки с большим размером ячейки и средняя интенсивность плотной перинуклеарной сети KIF были независимо проанализированы с использованием инструмента рисования ImageJ.Чтобы количественно оценить потерю кератинов на периферии клетки, значения интенсивности периферического KIF были разделены на значения интенсивности перинуклеарности.

Утолщение кератина оценивалось в проекциях максимальной интенсивности. Уровни интенсивности независимых экспериментов были скорректированы до той же базовой линии и дополнительно обработаны с помощью программного обеспечения CellProfiler (23). На первом этапе применялся трубчатый фильтр. Порог 0,2 был определен путем эмпирических испытаний и применен к изображениям на следующем этапе.Мостовой и очищающий фильтры применялись для закрытия небольших промежутков между пучками KIF или для удаления сигналов ошибки на один пиксель, соответственно. Полученные изображения отображали сигналы KIF высокой интенсивности в виде белого цвета, соответствующие утолщенным кератиновым пучкам. Средняя интенсивность этих изображений использовалась как мера утолщения KIF.

Интенсивность Dsg3 в мембране анализировали с использованием проекции из трех слоев (1,5 мкм), расположенных выше и ниже плоскости с наибольшим диаметром ядра. Для визуализации были включены только клетки с четкой мембранной локализацией.Среднюю интенсивность интересующей области шириной 2 мкм, содержащей всю окружность клетки, сравнивали с интенсивностью оставшейся цитоплазмы (за исключением области ядра, лишенной каких-либо сигналов). Мы использовали этот индекс для обнаружения переключения интенсивности от границы клетки в цитоплазму в качестве индикатора интернализации Dsg3.

Чтобы определить кластеризацию мембраны Dsg3, полоса длиной 10 мкм и шириной 10 пикселей была нарисована поверх сигнала Dsg3 на мембране, и профиль интенсивности строился каждые 12 минут в той же области.На кластеризацию указывают пики интенсивности в профиле, развивающиеся с течением времени. Их количественно оценивали следующим образом. Сначала рассчитывали среднее значение интенсивности начального 0-минутного профиля. Это значение было умножено на 1,5 и использовано в качестве порогового значения для последующих временных точек. Чтобы обнаружить вновь возникающие пики на профилях, мы рассчитали площадь под кривой выше этого порога.

Обработка данных и статистика

Photoshop CC 2017 (Adobe Systems, Сан-Хосе, Калифорния, США) использовался для обработки и компиляции изображений.Для анализа данных мы использовали программу Excel (Microsoft, Редмонд, Вашингтон, США). Статистическую значимость определяли с использованием парного теста Стьюдента t для двухгрупповых сравнений в Excel или однофакторного дисперсионного анализа с последующей коррекцией Бонферрони с использованием Graphpad Prism (Graphpad Software, LaJolla, CA, USA) для сравнения более двух групп. Значимость предполагалась с p <0,05. Показанные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Результаты

Аутоантитела к пузырчатке, индуцированные истощением Dsg3 и ретракцией кератина

In vitro

Первоначально мы охарактеризовали изменения в распределении Dsg3 и кератина в статических условиях в культивируемых кератиноцитах человека.Кератиноциты HaCaT, стабильно экспрессирующие YFP-меченый CK5, инкубировали с PV1-IgG в течение 2, 12 и 24 часов (Фигуры 1A, B). Через 12 часов, а тем более после 24 часов инкубации, кератиновый цитоскелет казался втянутым от периферии клетки (стрелки), и была видна кластеризация Dsg3 вместе с уменьшенной локализацией вдоль границы клетки. В соответствии с предыдущими данными (24), Dsg3 был линеаризован в массивах, перпендикулярных границе клетки, и присутствовали внутриклеточные кластеры Dsg3 (стрелки), напоминающие об интернализации.Через 2 часа распределение Dsg3 показало незначительные изменения, и было обнаружено начальное снижение интенсивности кератина на границах клеток. Через 24 часа количество CK5 и Dsg3 было снижено в цитоскелетном (нерастворимом Triton X-100) пуле (рис. 1B). Это указывает на разрушение сети KIF после более длительных периодов лечения PV-IgG.

Рисунок 1 . Структурные изменения кератиноцитов человека в ответ на воздействие антител к пузырчатке обыкновенной (PV). Кератиноциты HaCaT, экспрессирующие цитокератин5 (CK5) -YPF (HaCaT-CK5), инкубировали с PV1-IgG в течение 2, 12 или 24 часов.Показанные изображения являются представителями более 3 независимых экспериментов. (A) Окрашивание десмоглеином (Dsg) 3 и экспрессия CK5 в ответ на связывание антитела. Потеря кератиновых волокон на периферии клетки отмечена стрелками, а изменения Dsg3 — стрелками. Сравнение профилей флуоресценции на линии 15 мкм перпендикулярно мембране двух соседних клеток ( n = 75 клеток из трех независимых экспериментов, * p <0,05 по сравнению с контролем). Столбик соответствует 10 мкм. (B) Нерастворимая фракция Triton X-100, представляющая связанную с цитоскелетом фракцию лизатов HaCaT-CK5 после инкубации с PV1-IgG в течение указанного периода времени ( n = 6). Денситометрический анализ структурных белков показан как кратность контроля ( n = 6, * p <0,05 по сравнению с контролем). (C) Анализ диссоциации на основе диспазы в кератиноцитах HaCaT-CK5 после обработки PV1-IgG ( n = 5, * p <0,05 по сравнению с контролем).Репрезентативные изображения клеточных листов после приложения сдвигового напряжения, окрашенного 10 мкМ МТТ для лучшей видимости.

Несмотря на лишь незначительные изменения, обнаруживаемые при иммуноокрашивании через 2 часа инкубации PV1-IgG, межклеточная адгезия была нарушена, как показали анализы диссоциации на основе диспазы (рис. 1C). В соответствии со структурными изменениями, когезия клеток была сильнее нарушена в более поздние моменты времени. В совокупности примененная здесь клеточная линия демонстрирует типичные признаки заболевания, которые также проявляются в кератиноцитах кожи пациента с пузырчаткой (25).

Временной ход изменений KIF в ответ на PV-IgG в значительной степени неизвестен. Недавно с помощью атомно-силовой микроскопии было продемонстрировано изменение цитоскелетной сети в живых кератиноцитах в течение первых 2 часов (26). Поскольку изменения KIF и Dsg3 начались примерно через 2 часа после добавления аутоантител в статических экспериментах, мы затем выполнили визуализацию живых клеток в первые 2 часа с использованием кератиноцитов HaCaT, стабильно экспрессирующих CK5-YFP, для обнаружения потенциальных дискретных изменений в тех же клетках. В этом подходе мы провели трехмерную конфокальную покадровую микроскопию с высоким разрешением.Z-стеки, охватывающие всю высоту клетки, собирали с 30-секундными интервалами, и изменения в ответ на PV1-IgG анализировали в проекциях максимальной интенсивности. Сначала мы исследовали количество нитей, идущих перпендикулярно клеточной мембране (рис. 2А). Интересно, что эти структуры, которые, как известно, были относительно стабильными, не изменялись в течение 2 часов в отсутствие или в присутствии PV-IgG. Чтобы обнаружить потенциальные эффекты, которые могут быть скрыты в проекциях максимальной интенсивности, мы отдельно проанализировали нижние 4 мкм монослоя кератиноцитов, в котором сеть KIF была наиболее изменчивой (рис. 2B; см. Видео S1 в дополнительных материалах).Действительно, эти серии изображений показали значительную потерю флуоресценции кератина на периферии клеток, начиная примерно с 60 минут инкубации PV-IgG. В эти ранние временные точки общая степень наблюдаемых изменений была довольно умеренной, но четко определялась путем анализа интенсивности сигналов на периферии клетки. Чтобы оценить распределение в более длительных временных рамках, мы провели обзорные эксперименты при меньшем увеличении до 12 часов с уменьшенным временным разрешением. Интересно, что KIF конденсировались в более толстые пучки, которые становились видимыми примерно через 6 часов лечения PV1-IgG и продолжали прогрессировать (рис. 2C).Для анализа был применен шаг пороговой обработки и проанализировано количество сигнала, превышающего этот порог (см. Материалы и методы).

Рисунок 2 . Динамика изменения кератина после связывания антител. Репрезентативная последовательность изображений трехмерной конфокальной покадровой микроскопии высокого разрешения как проекция максимальной интенсивности полной высоты клетки HaCaT-CK5 (A) . Изображения получали с 30-секундными интервалами, а количество кератиновых мостиков оценивали каждые 6 минут после добавления PV1-IgG ( n = 8–10 клеток в трех-четырех независимых экспериментах, * p <0.05 по сравнению с контрольным IgG в соответствующий момент времени). (B) В проекции максимальной интенсивности, содержащей нижние 4 мкм тела клетки, отношение интенсивности флуоресценции на периферии клетки к интенсивности флуоресценции в цитоплазме анализировали каждые 6 минут. Стрелками отмечена потеря интенсивности флуоресценции на периферии клетки. Пунктирными линиями обозначена область границы клеток, они были нарисованы для лучшей визуализации ( n = 8–10 клеток из трех-четырех независимых экспериментов, * p <0.05 по сравнению с контрольным IgG в соответствующий момент времени). (C) Кератиновое связывание (стрелки) было вызвано воздействием PV1-IgG. Объединение визуализировали, устанавливая пороговое значение для исходных данных и измеряя оставшуюся интенсивность ( n = 3–4, * p <0,05 по сравнению с контрольным IgG в соответствующий момент времени). Полосы представляют собой 10 мкм.

В совокупности эксперименты по визуализации живых клеток предполагают двухфазное влияние связывания аутоантител на распределение кератиновых филаментов. Первоначально пул, расположенный на периферии клетки и потенциально ответственный за сборку KIF, уменьшается, что сопровождается конденсацией более стабильных филаментов, закрепляющих десмосомы.

Кератин изменяет параллельную кластеризацию Dsg3 и предшествующую интернализацию Dsg3

Затем мы дополнительно исследовали временную взаимосвязь между изменениями кератина и интернализацией Dsg3. Мы создали конструкцию Dsg3, слитую на С-конце с mCherry, и использовали ее для трансфекции клеток HaCaT, стабильно экспрессирующих CK5-YFP. Подобно экспериментам без двойной трансфекции, уменьшение кератиновой сети на периферии клетки стало очевидным, начиная с 60 мин инкубации PV1-IgG, что указывает на то, что сверхэкспрессия Dsg3 не изменяет динамику кератина (рисунки 3A, B; см. Видео S1 в дополнительном документе). Материал).Сигналы Dsg3 на границах клеток были стабильными в течение 90 мин инкубации PV1-IgG и после этого начали снижаться, что продемонстрировано анализом интенсивности мембран (Фигуры 3A, C). Таким образом, количество Dsg3 в мембране, по-видимому, снижается позже, чем изменяется CK5. Экзогенная экспрессия CK5 не была защитной в отношении интернализации Dsg3, поскольку клетки HaCaT дикого типа, трансфицированные Dsg3-GFP, показали аналогичные результаты (фигура S1 в дополнительном материале). Чтобы подтвердить эти данные визуализации, мы выполнили анализы биотинилирования клеточной поверхности, чтобы биохимически определить степень истощения мембраны Dsg3 (рис. 3D).В соответствии с данными визуализации в реальном времени, только незначительное снижение мембранных уровней Dsg3 было обнаружено через 2 часа, тогда как истощение мембраны было выражено через 12 и 24 часа инкубации PV2-IgG, соответственно. Стабильные уровни мембраны Dsg3 не исключают изменений в распределении молекул. Было показано, что кластеризация молекул Dsg3 внутри мембраны в ответ на PV-IgG предшествует интернализации (24). Таким образом, мы проанализировали кластеризацию Dsg3 в экспериментах с живыми клетками, которая была обнаружена сначала после 60 мин инкубации PV-IgG и продолжалась во времени (рисунки 3A, E, стрелки).Параллельно с этими экспериментами мы внимательно следили за сплоченностью клеток с помощью анализов диссоциации на основе диспазы (рис. 3F). По сравнению с грубым разрушением монослоя, обычно очевидным через 24 часа инкубации, в эти ранние моменты времени фрагментация монослоя в основном обнаруживалась на периферии, предположительно потому, что клетки в этой области немного менее плотны. По сравнению с контрольным IgG, фрагментация и, следовательно, потеря межклеточной адгезии значительно увеличивались, начиная с 30 мин инкубации PV2-IgG, и увеличивались в дальнейшем.

Рисунок 3 . Кератиновые изменения и кластеризация Dsg3 происходят параллельно и предшествуют интернализации Dsg3. Кератиноциты HaCaT, экспрессирующие CK5-YFP, трансфицировали Dsg3-mCherry. В экспериментах по трехмерной конфокальной покадровой микроскопии клетки инкубировали либо с PV1-IgG, либо с контрольным IgG, и отображали изображения каждые 2 мин в течение 120 мин. Пунктирными линиями обозначены пограничные области клеток (A) . Отношение интенсивности флуоресценции CK5 и на периферии клеток к интенсивности в цитоплазме было оценено как (B) ( n = 5–6 клеток, каждая из независимого эксперимента, * p <0.05 по сравнению с контрольным IgG в соответствующий момент времени). Соотношение распределения Dsg3 в мембране и цитоплазме (C) ( n = 5–6, * p <0,05 по сравнению с контрольным IgG). Удаление стрептавидином биотинилированной мембраны Dsg3 через 2, 12 и 24 ч инкубации PV2-IgG и денситометрический анализ уровней белка ( n = 3–4, * p <0,05 по сравнению с контролем) (D) . Кластеризация Dsg3 оценивалась по линейному графику профиля интенсивности вдоль мембраны ( n = 5–6, * p <0.05 по сравнению с контрольным IgG в соответствующий момент времени) (E) . Потеря клеточной адгезии, вызванная инкубацией с PV2-IgG, измерялась параллельно со структурными изменениями в ранние моменты времени с помощью анализа диссоциации на основе диспазы (F) ( n = 4–5, * p <0,05 vs. соответствующая инкубация Control-IgG).

Эти результаты демонстрируют, что изменения в распределении KIF параллельны потере клеточной когезии и кластеризации Dsg3, но предшествуют морфологически и биохимически детектируемой интернализации Dsg3.

Ингибирование СК-1 Изменение распределения кератина аналогично PV-IgG

Наблюдение, что изменения KIF соответствуют кластеризации Dsg3, но предшествуют истощению Dsg3 из мембраны, свидетельствует о кератин-зависимой регуляции обмена Dsg3. Чтобы проверить эту гипотезу, необходим подход, индуцирующий ретракцию кератина независимо от связывания аутоантител с Dsg3. Недавно было идентифицировано, что CK-1α опосредует организацию кератинового цитоскелета FAM83H-зависимым образом (18).CK-1α регулирует нитевидное состояние кератиновых волокон, и его ингибирование способствует объединению кератина в пучки вблизи ядра. Фенотип реорганизации кератина при ингибировании CK-1α близко соответствовал фенотипу, наблюдаемому при PV.

Мы визуализировали эффект ингибитора CK-1 D4476 на клетки HaCaT, экспрессирующие CK5-YFP. Ингибирование CK-1 вызвало потерю периферических кератиновых филаментов через 1 час, напоминая PV-IgG-индуцированное втягивание кератина (рис. 4A). В соответствии с регуляцией KIF с помощью CK-1, D4476-индуцированное дефосфорилирование CK14, как показано в экспериментах с Phos-Tag (фиг. 4B).Удаление кератина в ответ на связывание аутоантител в PV связано с быстрым усилением передачи сигналов p38MAPK. Ингибирование p38MAPK предотвращает перестройку кератинового цитоскелета и потерю клеточной когезии (10). Кроме того, примененная здесь фракция PV-IgG индуцировала активацию p38MAPK (фиг. S1B в дополнительном материале; см. Также фиг. 6C). Подобно эффектам PV-IgG, уровни фосфо-p38MAPK были увеличены в ответ на инкубацию D4476 в течение 1 часа по сравнению с контрольными условиями (рис. 4C). Наконец, инкубация D4476 вызвала потерю клеточной когезии, что предотвращалось ингибированием p38MAPK посредством SB203580 (фигура 4D; фигура S1C в дополнительном материале).Тем не менее, снижение клеточной когезии в ответ на D4476 было дополнительно нарушено дополнительным применением AK23, моноклонального аутоантитела против Dsg3, полученного из модели пузырчатки на мышах (фигура 4E; фигура S1D в дополнительных материалах). Взятые вместе, изменения KIF в ответ на ингибирование CK-1 посредством D4476 напоминают индуцированное PV-IgG ретракцию кератина.

Рисунок 4 . Ингибирование казеинкиназы 1 спровоцировало кератиновые изменения, напоминающие фенотип, индуцированный PV-IgG.Клетки HaCaT-CK5 инкубировали с ингибитором CK-1 D4476 в течение 1 часа. Результирующую ретракцию кератина (стрелки) измеряли с помощью полоски длиной 15 мкм, перпендикулярной границе двух соседних клеток (A) ( n = 75–100 клеток в трех-четырех независимых экспериментах, * p <0,05 против 1 ч ДМСО). Пруток 10 мкм. (B) Phos-tag ™ включали в 6% гель вестерн-блоттинга (+ Phos-tag) для определения статуса фосфорилирования CK14 в клетках HaCaT-CK5.Контрольный гель без Phos-tag (- Phos-tag) исключил фрагментацию белка. Интенсивность полосы обоих сайтов фосфорилирования была измерена, и первый сайт фосфорилирования (зеленая стрелка) был разделен на сайт базального фосфорилирования (красная стрелка) ( n = 4, * p <0,05 против 1 ч ДМСО). (C) Лизаты SDS получали из клеток, обработанных 1 ч D4476 или 1 ч ДМСО, и оценивали фосфорилирование p38MAPK. Денситометрические результаты были нормализованы к общему уровню p38 в качестве контроля нагрузки ( n = 6, * p <0.05 по сравнению с 1 ч ДМСО). Адгезию клеток определяли количественно в кератиноцитах HaCaT с помощью анализов диссоциации на основе диспазы. За предварительной инкубацией с SB203580 (SB20) в качестве специфического ингибитора p38MAPK или ДМСО в качестве контроля в течение 1 ч следовала инкубация D4476 в течение 1 ч ( n = 4–5, * p <0,05) (D) . Предварительная инкубация с D4476 или ДМСО в течение 1 часа с последующей 3-часовой инкубацией с AK23, патогенным моноклональным антителом к ​​десмоглеину (Dsg) 3 (E) ( n = 4, * p <0.05). Оставшиеся клеточные листы и фрагменты окрашивали 10 мкМ МТТ для визуализации.

Втягивание кератина не привело к интернализации Dsg3

Чтобы выяснить возможную зависимость ретракции кератина от распределения Dsg3, мы применили D4476 в экспериментах по визуализации живых клеток с человеческими кератиноцитами, экспрессирующими CK5-YFP, трансфицированные Dsg3-mCherry. Клетки предварительно инкубировали либо с D4476, либо с ДМСО, а затем инкубировали с PV2-IgG в течение 3 часов (см. Видео S2 в дополнительных материалах).Анализ изображений показал резкое снижение флуоресценции кератинового цитоскелета на периферии клетки при ингибировании CK-1, чего не происходило в контрольных условиях с ДМСО (Фиг.5А, стрелки). Интересно, что ретракция кератинового цитоскелета не происходила параллельно с интернализацией Dsg3. Однако дополнительная инкубация с PV2-IgG способствовала интернализации Dsg3, когда цитоскелет уже был изменен (стрелки). Мы дополнительно подтвердили эти находки с помощью иммуноокрашивания в условиях без сверхэкспрессии Dsg3 (Рисунок 5B).Подобно экспериментам с живыми клетками, Dsg3 оказался незатронутым в условиях опосредованного D4476 ретракции кератина. Тем не менее, кластеризация Dsg3 и внутриклеточные везикулы Dsg3 были обнаружены в обоих условиях после дополнительной инкубации с PV1-IgG (стрелки). В поддержку этих данных, удаление стрептавидином биотинилированных поверхностных молекул подтвердило отсутствие истощения Dsg3 из мембраны в обработанных D4476 культурах, которое индуцировалось после дополнительных 3 ч инкубации с PV2-IgG (фиг. 5C).

Рисунок 5 . Изменения кератина, вызванные D4476, не вызывали интернализации Dsg3. Кератиноциты HaCaT-CK5 трансфицировали pDest-mDsg3-mCherry, инкубировали с D4476 или DMSO и прослеживали с помощью трехмерной конфокальной покадровой микроскопии (A) . D4476 вызывал ретракцию кератина через 60 мин (стрелки), но не приводил к интернализации Dsg3. Последующее добавление PV2-IgG вызывало истощение мембраны Dsg3 (стрелки). Столбик представляет собой 10 мкм ( n = 4 клетки из 4 независимых экспериментов, * p <0.05). (B) Иммуноокрашивание кератиноцитов HaCaT-CK5 и Dsg3. Кератиновые изменения произошли при обработке D4476 (стрелки), и признаки фрагментации и интернализации Dsg3 были видны только в ответ на обработку PV1-IgG (стрелки). Показанные изображения являются репрезентативными для трех-четырех независимых экспериментов. Столбик соответствует 10 мкм. (C) Стрептавидиновый поток биотинилированного Dsg3 в клетках HaCaT-CK5, инкубированных с ДМСО или D4476 в течение 4 часов в качестве контроля и 1 час инкубации с последующей 3-часовой инкубацией PV2-IgG.Уровни Dsg3 в мембране оценивали денситометрически ( n = 3-5, * p <0,05 по сравнению с соответствующими контрольными условиями). (D) Dsg3-кластеризацию анализировали в 1-часовой последовательности визуализации живых клеток при инкубации DMSO или D4476. Кластеризацию детектировали с использованием стержня 10 мкм, линейно наложенного на мембрану ( n = 4, * p <0,05 по сравнению с ДМСО в соответствующий момент времени). Столбик соответствует 10 мкм.

Интересно, что хотя общие уровни в мембране не изменились, анализ распределения Dsg3 выявил кластеризацию Dsg3 в мембране после 60 мин обработки D4476 (рис. 5D).Эти данные показывают, что опосредованное D4476 перераспределение KIF не индуцирует интернализацию Dsg3, но вносит вклад в кластеризацию в мембране. Это указывает на то, что кластеризация Dsg3 и интернализация Dsg3 являются отдельными событиями и демонстрируют зависимость кластеризации Dsg3 от правильного распределения сети KIF. Напротив, интернализация Dsg3, по-видимому, не зависит от изменений KIF и может быть результатом других механизмов, вызываемых связыванием аутоантител с Dsg3.

Ингибирование интернализации Dsg3 не предотвратило ретракцию кератина

Сборка и разборка десмосом, как было показано, зависят от целостности липидного рафта (7, 27), которая может быть нарушена с помощью разрушающего холестерин агента метил-β-циклодекстрина (β-MCD).В связи с этим было показано, что нарушение формирования липидных рафтов сдерживает эндоцитоз Dsg3 после воздействия антител к PV (7). Мы использовали β-MCD для исследования зависимости изменений кератина, вызванных PV-IgG, от интернализации Dsg3. Анализы иммуноокрашивания и биотинилирования кератиноцитов человека, экспрессирующих CK5-YFP, показали, что предварительная инкубация в течение 1 часа с β-MCD в значительной степени предотвращала интернализацию Dsg3 после воздействия аутоантител (Фигуры 6A, B). Однако ретракция кератина все еще присутствовала в этих условиях, что указывает на независимость от изменений Dsg3.Несмотря на ограничение интернализации Dsg3 посредством разрушения липидного рафта и в соответствии с p38MAPK-зависимой регуляцией кератиновой сети, активация p38MAPK с помощью PV1-IgG не отменялась (фиг. 6C). В анализах диссоциации, основанных на диспазе, потеря межклеточной адгезии, вызванная PV2-IgG, улучшалась за счет разрушения липидного растра (рис. 6D). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что изменения кератина не зависят от эндоцитоза Dsg3 после инкубации PV-IgG. Более того, оба эффекта, по-видимому, способствуют потере сцепления клеток.Это предполагает разные механизмы, управляющие изменениями кератина и интернализацией Dsg3.

Рисунок 6 . Ингибирование интернализации Dsg3 через истощение холестерина не предотвращало изменения кератина, вызванные PV-IgG. Кератиноциты HaCaT-CK5 предварительно инкубировали либо с PBS, либо с β-MCD в качестве агента, истощающего холестерин, в течение 1 часа, а затем подвергали воздействию PV2-IgG в течение 6 часов. Представленные изображения (A) являются репрезентативными для четырех независимых экспериментов. Для анализа полоску 15 мкм прикладывали перпендикулярно к границе двух соседних клеток и наносили график интенсивности флуоресценции как для Dsg3, так и для CK5 ( n = 100 клеток из четырех независимых экспериментов; * p <0.05). Столбик соответствует 10 мкм. (B) Удаление стрептавидином биотинилированной мембраны Dsg3 проводили с кератиноцитами HaCaT-CK5 ( n = 3-5, * p <0,05). (C) Фосфорилирование p38MAPK определяли денситометрией. (D) Межклеточную адгезию определяли с помощью анализов диссоциации на основе диспазы в кератиноцитах HaCaT ( n = 8, * p <0,05).

Обсуждение

В настоящем исследовании мы показываем точный временной ход эндоцитоза Dsg3 и ретракции кератина в ответ на PV-IgG, анализируя временные отношения двух отличительных признаков PV.Наши результаты показывают, что оба механизма способствуют потере сцепления клеток, но, по-видимому, в значительной степени независимы друг от друга. Основываясь на наблюдении, что диссоциация клеток коррелирует с изменениями кератина перед началом интернализации Dsg3, эти результаты подтверждают важную роль ретракции кератина в потере сцепления клеток и образовании пузырей.

Кератиновые изменения предшествуют интернализации Dsg3

Является предметом споров, являются ли изменения KIF в ответ на аутоантитела к пузырчатке вторичными по отношению к изменениям десмосом или, скорее, вызывают и вносят вклад в изменение состава и оборота десмосом.Действительно, в ранних ультраструктурных исследованиях предполагалось, что начальные изменения влияют на KIF (20, 28). Здесь мы продемонстрировали, что изменения цитоскелета KIF видны в кератиноцитах HaCaT, начиная с 60 мин после нанесения аутоантител. Снижение межклеточной адгезии обнаруживается даже раньше, по крайней мере, при механическом стрессе, тогда как эндоцитоз Dsg3 не проявляется до 90 мин воздействия аутоантител. Интересно, что эти изменения не влияют на количество длинных нитей, идущих перпендикулярно клеточной мембране, предположительно закрепляющих десмосомы.Скорее, количество KIF в базальных и периферических областях клетки было снижено. Эти районы, как известно, являются регионами сборки KIF. Вполне возможно, что связывание аутоантител препятствует циклированию KIF, ограничивая сборку, что в конечном итоге может повлиять на целостность всей сети. Это подтверждается представлением о том, что уровни CK14 снижаются через несколько часов. В этом контексте утолщение оставшихся пучков через несколько часов можно интерпретировать как клеточный ответ на нарушение адгезии (3).Следует отметить, что в первичных кератиноцитах интернализация Dsg3 происходит через 60 мин (29). Это различие может быть связано с разными состояниями созревания десмосом в HaCaT по сравнению с первичными кератиноцитами (30) или различиями в патогенности применяемых фракций аутоантител. В текущем исследовании мы использовали клеточную линию HaCaT для повышения эффективности экспрессии двух больших белков по сравнению с первичными кератиноцитами.

Важно отметить, что нельзя исключить, что подход сверхэкспрессии, примененный в текущем исследовании, влияет на оборот соответствующих молекул.Например, было показано, что сверхэкспрессия Dsg3 замедляет его интернализацию и деградацию и снижает фрагментацию монослоя в ответ на антитела к пузырчатке (24). В нашем исследовании временные рамки интернализации Dsg3 трансфицированных и нетрансфицированных клеток оказались, по крайней мере, в значительной степени похожими, если судить по сравнению фиксированных, нетрансфицированных клеток на Рисунке 1A и визуализации живых клеток со сверхэкспрессией Dsg3 на Рисунке 3A. Тем не менее, возможно, что интернализация Dsg3 происходит быстрее в нетрансфицированных клетках.Интернализация Dsg3 показала аналогичные временные рамки в клетках HaCaT, экспрессирующих CK5-YFP, по сравнению с клетками только с эндогенными кератинами (сравните фиг. 3A; фиг. S1A в дополнительном материале). Это указывает на то, что сверхэкспрессия кератина не изменяет интернализацию Dsg3 в ответ на PV-IgG, но не исключает влияния на изменения кератина, которые также могут происходить быстрее в нетрансфицированных клетках. По крайней мере, в условиях, когда и Dsg3, и кератины сверхэкспрессируются, начальные кератиновые изменения предшествуют интернализации Dsg3.

Неясно, связаны ли KIF на периферии базальных клеток, которые рано истощаются в ответ на PV-IgG, с десмосомами. Напротив, последствия для клеточной адгезии могут быть косвенными. Изоформы белков десмосомных бляшек Dp и Pkp собираются в смежной мембране вместе с уже прикрепленными кератиновыми филаментами и затем транспортируются к формирующимся десмосомам (31, 32). Возможно, что этот процесс нарушен за счет снижения сборки KIF, опосредованной аутоантителами.С другой стороны, феномен междесмосомного расширения может быть связан с изменениями KIF. Известно, что мембраны соседних кератиноцитов разделяются между десмосомами на очень ранних стадиях после инкубации аутоантител (33, 34). Поскольку сеть KIF является основным фактором, определяющим жесткость кератиноцитов (35, 36), возможно, что уменьшение периферии клетки способствует разделению мембран в междесмосомных областях. Также может способствовать ослабление субплазмалеммальной сети KIF, которая может стабилизировать междесмосомные мембранные области (37).Это подтверждается наблюдениями, что ингибирование p38MAPK, которое блокирует ретракцию кератина, обнаруженную на статических изображениях, также снижает междесмосомное расширение (38). Это говорит о том, что области междесмосомной мембраны вносят вклад в общую адгезию клеток.

Наблюдение, что изменения цитоскелета KIF, по сравнению с интернализацией Dsg3, лучше коррелируют с потерей сцепления клеток, указывает на основной вклад в индуцированную PV-IgG диссоциацию клеток. Этот механизм может вносить вклад в начальную потерю клеточной сплоченности, которая может быть вызвана стерическими препятствиями взаимодействий Dsg3 с помощью PV-IgG.Действительно, из нокаут-исследований можно сделать вывод, что кератины необходимы для прочной межклеточной адгезии in vivo, и , in vitro, (16, 39). Кроме того, было показано, что в клетках, лишенных кератинов, силы, с помощью которых две молекулы Dsg3 транс-взаимодействуют, были снижены p38MAPK-зависимым образом (40).

Основываясь на этих результатах, изменения KIF, по-видимому, не являются вторичными по отношению к изменениям молекул десмосомной адгезии, но вносят вклад в потерю клеточной когезии даже в очень ранних ответах на провокацию PV-IgG.

Истощение Dsg3 и кератиновые изменения можно регулировать независимо

Учитывая временную взаимосвязь изменений KIF и интернализации Dsg3, можно предположить, что эти два события причинно связаны и истощение мембраны Dsg3 является следствием измененного распределения KIF. Однако наши результаты с ингибитором СК-1 D4476 не подтверждают эту гипотезу. Ингибирование CK-1 привело к фенотипу KIF, напоминающему эффект инкубации PV-IgG. В этих условиях не было обнаружено интернализации или истощения Dsg3, тогда как дополнительная инкубация с PV-IgG индуцировала эндоцитоз Dsg3.Это поддерживает модель, в которой локализация мембраны Dsg3 не зависит от изменений KIF. В соответствии с этими наблюдениями, кератиноциты, полученные от животных с нокаутом кератина, имеют меньшие десмосомы и пониженные уровни некоторых десмосомных молекул, таких как Dsg2, но имеют повышенные уровни Dsg3 и неизменное содержание плакоглобина (16, 39, 40). Следовательно, влияние кератинов на десмосомные белки не влияет равномерно на все молекулы, что может быть связано с наблюдениями, что десмосомные молекулы по-разному вносят вклад в сплоченность клеток (41, 42).

Однако, хотя уровни Dsg3 в мембране не изменялись, кластеризация Dsg3 увеличивалась в условиях D4476-опосредованной реорганизации KIF. Вместе с понятием из предыдущих данных, показывающим, что подвижность Dsg3 в мембране повышена в кератиноцитах, лишенных KIFs (40), это может указывать на то, что Dsg3 исключен из десмосом и образует кластеры, которые подвергаются интернализации. Действительно, такая модель подтверждается исследованиями импульсной погони и экспериментами с живыми клетками (24, 43) по доставке Dsg3 в ответ на PV-IgG.В этом сценарии для эндоцитоза Dsg3, индуцированного PV-IgG, потребуется первая стадия кластеризации, которая обычно подавляется кератином или вставкой кератина, и вторая стадия интернализации, которая не зависит от кератинов. Для последнего этапа могут быть необходимы липидные рафты (7).

Основываясь на этих наблюдениях, мы ингибировали эндоцитоз Dsg3 путем вмешательства в состав липидного растра посредством применения β-MCD. Интересно, что это устраняет эндоцитоз Dsg3, но не предотвращает изменения KIF, указывая тем самым, что они происходят независимо от интернализации Dsg3.

К последовательности структурных изменений, приводящих к диссоциации клеток

Результаты этого исследования и предыдущей работы нескольких групп могут быть интегрированы в модель, в которой отдельные морфологические признаки сливаются, чтобы постепенно увеличивать диссоциацию клеток (Figure 7). Было показано, что антитела против Dsg3 стерически ингибируют транс-взаимодействия с Dsg3 (26, 44), которые могут вносить вклад в начальную потерю сцепления клеток и представлять собой триггер для активации p38MAPK (11). Это, вместе с эффектами сшивания поливалентных аутоантител против Dsg3, вызывает раннее кластеризацию молекул Dsg3 в клеточной мембране (24, 45).Ранние изменения в сборке кератина могут способствовать этому эффекту, который также, по-видимому, опосредован p38MAPK и воспроизводится посредством ингибирования CK-1 в этом исследовании. За кластеризацией Dsg3 следует интернализация Dsg3, процесс, который зависит от липидных рафтов (7). Эндоцитоз Dsg3 вместе с интернализацией других десмосомных молекул приводит к дестабилизации десмосом. Важно отметить, что интернализация десмосомных молекул влияет как на сборку, так и на разборку десмосом, что приводит к уменьшению размера и количества десмосом (4, 5).Потеря или разъединение KIF с десмосом, возможно, подкрепленное измененным оборотом кератина, способствует дестабилизации десмосом и , наоборот, (39, 40). Наконец, утолщение кератиновых филаментов, наблюдаемое на более поздних стадиях, может представлять общий клеточный стрессовый ответ или может быть интерпретировано как бесполезная попытка усилить межклеточную адгезию за счет лучшего закрепления оставшихся десмосом. Другие механизмы, описанные до сих пор при пузырчатке, такие как различные изменения во внутриклеточной передаче сигналов, появление недесмосомных аутоантител или генетический фон (6), могут вносить свой вклад, модулируя эти морфологические изменения.Возможно, что некоторые из этих шагов должны произойти, чтобы вызвать полную потерю клеточной когезии и образование пузырей. В зависимости от экспериментальной установки (например, фракция IgG, зависимость десмосом от Ca ²⁺ , модельная система) некоторые из этих шагов могут быть более важными, чем другие. Это может объяснить некоторые противоречия, существующие в области исследования пузырчатки.

Рисунок 7 . Обзор морфологических изменений, ведущих к потере адгезии кератиноцитов в ответ на pemphigus vulgaris-IgG.

Заявление об этике

Сыворотки, использованные в настоящем исследовании, были собраны в соответствии с рекомендациями этического комитета Университета Любека, AZ12-178; название проекта: Autoantikörperreaktivität und Pathophysiologie bei blasenbildenden Autoimmunerkrankungen (Pemphigoid und Pemphigus).

Авторские взносы

ES провела эксперименты и проанализировала данные. Созданные MR конструкции. FV и CS контролировали эксперименты и анализировали данные. JW и VS проанализировали данные и интерпретировали результаты.VS разработал исследование. ES и VS написали рукопись.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Финансирование

Исследование было поддержано грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft SP1300 / 1-3 и SP1300 / 3-1 для VS, а также программой Föfole LMU.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2018.00858/full#supplementary-material.

Видео S1 . Клетки HaCaT-CK5 трансфицировали pDest-mDsg3-mCherry и инкубировали с PV1-IgG в течение 120 мин. Изображения получали каждые 2 мин.

Видео S2 . 60-минутная инкубация D4476 в клетках HaCaT-CK5, трансфицированных pDest-mDsg3-mCherry, с последующей 180-минутной инкубацией PV2-IgG. Изображения собирались каждые 2 мин.

Рисунок S1. (A) кератиноцитов HaCaT дикого типа показали такой же ход интернализации Dsg3 во времени, что и HaCaT, экспрессирующие желтый флуоресцентный белок цитокератин5 (CK5) ( n = 4, * p <0.05). (B) Лизаты HaCaT-CK5 были обработаны в нерастворимый и растворимый пул TX-100, показывающий активацию p38MAPK ( n = 4). (C, D) Активация p38MAPK и уровни белка в клетках HaCaT-CK5 после указанной обработки, которые коррелируют с фигурами 4D, E. Клетки обрабатывали для вестерн-блоттинга в виде лизатов SDS [панель (C) : n = 4, панель (D) : n = 3-5].

Ссылки

3. Hatzfeld M, Keil R, Magin TM.Десмосомы и промежуточные филаменты: их последствия для механики тканей. Cold Spring Harb Perspect Biol (2017) 9 (6). DOI: 10.1101 / cshperspect.a029157

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Китадзима Ю. 150-я юбилейная серия: десмосомы и аутоиммунные заболевания, перспективы динамического ремоделирования десмосом и ее нарушения при пузырчатке. Cell Commun Adhes (2014) 21: 269–80. DOI: 10.3109 / 15419061.2014.943397

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6.Spindler V, Eming R, Schmidt E, Amagai M, Grando S, Jonkman MF и др. Механизмы, вызывающие потерю сцепления кератиноцитов при пузырчатке. J Invest Dermatol (2018) 138 (1): 32–7. DOI: 10.1016 / j.jid.2017.06.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Стали С.Н., Сайто М., Фаундез В., Коваль М., Маттейсес А.Л., Ковальчик А.П. Сборка и разборка десмосом зависят от мембранного рафта. PLoS One (2014) 9: e87809. DOI: 10.1371 / journal.pone.0087809

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Воллнер Ф., Али Дж., Куррле Н., Экснер Й., Эминг Р., Хертл М. и др. Потеря экспрессии флотилина приводит к ослаблению десмосомальной адгезии и вульгарной пузырчатке локализации десмоглеина-3 в кератиноцитах человека. Sci Rep (2016) 6: 28820. DOI: 10.1038 / srep28820

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Джолли П.С., Берковиц П., Бектас М., Ли Х.Е., Чуа М., Диаз Л.А. и др.Передача сигналов p38MAPK и интернализация десмоглеина-3 связаны событиями при акантолизе пузырчатки. J Biol Chem (2010) 285: 8936–41. DOI: 10.1074 / jbc.M109.087999

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Берковиц П., Ху П., Лю З., Диас Л.А., Энгилд Дж.Дж., Чуа М.П. и др. Передача сигналов десмосом. Ингибирование p38MAPK предотвращает реорганизацию цитоскелета, вызванную IgG пузырчатки обыкновенной. J Biol Chem (2005) 280: 23778–84. DOI: 10.1074 / jbc.M501365200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11.Шпиндлер В., Ротцер В., Денер С., Кемпф Б., Глиэм М., Радева М. и др. Опосредованное пептидом сшивание десмоглеина 3 предотвращает образование пузырей на коже, вызванное аутоантителами pemphigus vulgaris. J Clin Invest (2013) 123: 800–11. DOI: 10.1172 / JCI60139

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Sawant MS, Leube RE. Последствия фосфорилирования кератина для организации цитоскелета и эпителиальных функций. Int Rev Cell Mol Biol (2017) 330: 171–225.DOI: 10.1016 / bs.ircmb.2016.09.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Leube RE, Moch M, Kolsch A, Windoffer R. «Panta rhei»: вечное вращение кератинового цитоскелета. Биоархитектура (2011) 1: 39–44. DOI: 10.4161 / bioa.1.1.14815

CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Kröger C, Loschke F, Schwarz N, Windoffer R, Leube RE, Magin TM. Кератины контролируют межклеточную адгезию с участием PKC-α-опосредованного фосфорилирования десмоплакина. J Cell Biol (2013) 201: 681–92. DOI: 10.1083 / jcb.201208162

CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Денер С., Ротцер В., Вашке Дж., Шпиндлер В. Точечная мутация десмоплакина с усиленной ассоциацией кератина улучшает опосредованную аутоантителами пузырчатку обыкновенную потерю клеточной когезии. Am J Pathol (2014) 184: 2528–36. DOI: 10.1016 / j.ajpath.2014.05.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Куга Т., Куме Х., Кавасаки Н., Сато М., Адачи Дж., Широмидзу Т. и др.Новый механизм организации кератинового цитоскелета с помощью казеинкиназы Ialpha и FAM83H при колоректальном раке. J Cell Sci (2013) 126: 4721–31. DOI: 10.1242 / jcs.129684

CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Куга Т., Сасаки М., Миками Т., Миаке Й., Адачи Дж., Симидзу М. и др. FAM83H и казеинкиназа I регулируют организацию кератинового цитоскелета и образование десмосом. Sci Rep (2016) 6: 26557. DOI: 10.1038 / srep26557

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20.Вилграм Г. Ф., Колфилд Дж. Б., Рычаг В. Ф. Электронно-микроскопическое исследование акантолиза вульгарной пузырчатки. J Invest Dermatol (1961) 36: 373–82. DOI: 10.1038 / jid.1961.58

CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Вашке Дж., Брюггеман П., Баумгартнер В., Зилликенс Д., Дренкхан Д. Pemphigus foliaceus IgG вызывает диссоциацию соединений, содержащих десмоглеин 1, не блокируя трансвзаимодействие с десмоглеином 1. J Clin Invest (2005) 115: 3157–65. DOI: 10.1172 / JCI23475

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22.Сиварамакришнан С., ДеДжиулио СП, Лоранд Л., Голдман Р.Д., Ридж К.М. Микромеханические свойства кератиновых сетей промежуточных филаментов. Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105: 889–94. DOI: 10.1073 / pnas.0710728105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Карпентер А.Е., Джонс Т.Р., Лампрехт М.Р., Кларк С., Канг И.Х., Фриман О. и др. CellProfiler: программное обеспечение для анализа изображений для определения и количественной оценки фенотипов клеток. Genome Biol (2006) 7: R100.DOI: 10.1186 / GB-2006-7-10-r100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Дженнингс Дж. М., Такер Д. К., Коттке М. Д., Сайто М., Дельва Е., Ханакава Ю. и др. Разборка десмосом в ответ на pemphigus vulgaris IgG происходит в разные фазы и может быть обращена экспрессией экзогенного Dsg3. J Invest Dermatol (2011) 131: 706–18. DOI: 10.1038 / jid.2010.389

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Вильмут Ф., Вашке Дж., Шпиндлер В.Потеря связывания десмоглеина недостаточна для диссоциации кератиноцитов при пузырчатке. J Invest Dermatol (2015) 135: 3068–77. DOI: 10.1038 / jid.2015.324

CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Резник Н., Сепчич К., Племениташ А., Виндоффер Р., Лейбе Р., Веранич П. Сборка десмосом и клеточно-клеточная адгезия являются процессами, зависящими от мембранного рафта. J Biol Chem (2011) 286: 1499–507. DOI: 10.1074 / jbc.M110.189464

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28.Стоутон РБ. Механизмы образования пузырей. AMA Arch Derm (1957) 76: 584–90. DOI: 10.1001 / archderm.1957.01550230050008

CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Калкинс С.К., Сетцер С.В., Дженнингс Дж.М., Саммерс С., Цунода К., Амагай М. и др. Эндоцитоз десмоглеина и разборка десмосом являются скоординированными ответами на аутоантитела к пузырчатке. J Biol Chem (2006) 281: 7623–34. DOI: 10.1074 / jbc.M512447200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30.Spindler V, Endlich A, Hartlieb E, Vielmuth F, Schmidt E, Waschke J. Степень истощения десмоглеина 3 при пузырчатке обыкновенной зависит от дифференцировки, индуцированной Ca (2 +): роль в надбазальном эпидермальном расщеплении кожи? Am J Pathol (2011) 179: 1905–16. DOI: 10.1016 / j.ajpath.2011.06.043

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Альбрехт Л.В., Чжан Л., Шабановиц Дж., Пуревьяв Э., Таубин Дж. А., Хант Д. Ф. и др. GSK3- и PRMT-1-зависимые модификации десмоплакина контролируют динамику десмоплакин-цитоскелета. J Cell Biol (2015) 208: 597–612. DOI: 10.1083 / jcb.201406020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Годсель Л.М., Се С.Н., Амарго Э.В., Басс А.Е., Паско-МакГилликадди Л.Т., Хуэн А.С. и др. Динамика сборки десмоплакина в четырех измерениях. J Cell Biol (2005) 171: 1045–59. DOI: 10.1083 / jcb.200510038

CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Диркс Г.Ф., Пас HH, Йонкман М.Ф. Ультраструктура акантолиза при вульгарной пузырчатке. Br J Dermatol (2009) 160: 460–1. DOI: 10.1111 / j.1365-2133.2008.08971.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Хашимото К., Рычаг ВФ. Ультраструктурное исследование клеточных соединений вульгарной пузырчатки. Arch Dermatol (1970) 101: 287–98. DOI: 10.1001 / archderm.1970.04000030031005

CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Раммс Л., Фабрис Дж., Виндоффер Р., Шварц Н., Спрингер Р., Чжоу С. и др. Кератины как основной компонент механической целостности кератиноцитов. Proc Natl Acad Sci U S A (2013) 110: 18513–8. DOI: 10.1073 / pnas.13134

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Зельтманн К., Фрич А.В., Кас Дж. А., Магин TM. Кератины значительно повышают жесткость клеток и влияют на агрессивное поведение. Proc Natl Acad Sci U S A (2013) 110: 18507–12. DOI: 10.1073 / pnas.1310493110

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Куинлан Р.А., Шварц Н., Виндоффер Р., Ричардсон С., Хокинс Т., Бруссард Дж. А. и др.Гипотеза ободка и спиц для объяснения биомеханической роли цитоплазматических сетей промежуточных филаментов. J Cell Sci (2017) 130: 3437–45. DOI: 10.1242 / jcs.202168

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Egu DT, Walter E, Spindler V, Waschke J. Ингибирование передачи сигналов p38MAPK предотвращает образование пузырей в эпидермисе и изменения структуры десмосом, вызванные аутоантителами пузырчатки в эпидермисе человека. Br J Dermatol (2017) 177 (6): 1612–8.DOI: 10.1111 / bjd.15721

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Бар Дж., Кумар В., Рот В., Шварц Н., Рихтер М., Лейбе Р. Э. и др. Хрупкость кожи и нарушение десмосомальной адгезии у мышей, лишенных всех кератинов. J Invest Dermatol (2014) 134: 1012–22. DOI: 10.1038 / jid.2013.416

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Вильмут Ф., Вануске М.Т., Радева М.Ю., Хирмайер М., Кугельманн Д., Вальтер Э. и др. Кератины регулируют адгезивные свойства десмосомных кадгеринов посредством передачи сигналов. J Invest Dermatol (2018) 138 (1): 121–31. DOI: 10.1016 / j.jid.2017.08.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Hartlieb E, Kempf B, Partilla M, Vigh B, Spindler V, Waschke J. Десмоглеин 2 менее важен, чем десмоглеин 3, для слипания кератиноцитов. PLoS One (2013) 8: e53739. DOI: 10.1371 / journal.pone.0053739

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Аояма Ю., Нагаи М., Китадзима Ю.Связывание IgG пузырчатки обыкновенной с антигенами в основных доменах десмосом исключает иммунные комплексы, а не прямое расщепление десмосом. Br J Dermatol (2010) 162: 1049–55. DOI: 10.1111 / j.1365-2133.2010.09672.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Heupel WM, Zillikens D, Drenckhahn D, Waschke J. Pemphigus vulgaris IgG непосредственно ингибируют опосредованное десмоглеином 3 трансвзаимодействие. J Immunol (2008) 181: 1825–34. DOI: 10.4049 / jimmunol.181.3.1825

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Сайто М., Стейли С.Н., Когман С.Ю., Мао Х, Такер Д.К., Пейн А.С. и др. Сигнальные зависимые и независимые механизмы образования пузырей вульгарной пузырчатки. PLoS One (2012) 7: e50696. DOI: 10.1371 / journal.pone.0050696

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

.